RNAEx ZOL总RNA提取试剂-100ml

【操作方法】

1. 样品处理：

a. 组织：将组织在液氮中研磨，磨碎后及时于每50-100mg组织中加入1ml RNAEx ZOL Reagent，样品体积不应超过RNAEx ZOL Reagent体积的10%（或使用匀浆仪器）。

b. 单层细胞：直接在培养皿中裂解细胞，如35mm直径的培养皿中加入1ml RNAEx ZOL Reagent，使用吸头吹匀促进细胞裂解。RNAEx ZOL Reagent的试剂量基于培养的表面积而不是细胞数量（每10cm²加入1ml RNAEx ZOL Reagent），RNAEx ZOL Reagent试剂量不足可能会导致分离出的RNA有DNA污染。

c. 悬浮细胞：先低速离心沉淀细胞，弃培养液后加入RNAEx ZOL Reagent（1ml RNAEx ZOL Reagent加入至5×10⁶动物、植物、酵母或细菌细胞中）。加入RNAEx ZOL Reagent前避免洗涤细胞，这容易导致mRNA降解。一些酵母和细菌细胞的裂解可能需要使用均质器。

可选：一些样品可能需要额外的分享步骤，这些样品蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高，如肌肉、脂肪组织、以及部分植物块茎。在根据上述方式处理后，于2-8°C，12000g离心10分钟，移除沉淀不溶物，RNA存于上清中。

2. 相分离

a. 将加完RNAEx ZOL Reagent后的样品在室温（15-30°C）静置5分钟，以利于样品核蛋白体完全分离

b. 按每1ml RNAEx ZOL Reagent加入0.2ml 氯仿（自备），小心盖好样品管后，剧烈震荡15秒，后置于室温（15-30°C）静置2-3分钟。

c. 2-8°C，10000g离心15分钟。离心后，混合物分离为下层（酚-氯仿相）、中间相以及上层无色水相。RNA存在于上层无色水相中，体积约为最初加入RNAEx ZOL Reagent体积的60%左右。

RNA分离提取步骤：

1. RNA沉淀

a. 将上述水相转移到一个新的管中，并保存有机相（若希望分离DNA或蛋白质）。混合异丙醇从水相中沉淀RNA，每1ml 用于初始裂解的RNAEx ZOL Reagent使用0.5ml 异丙醇，室温（15-30°C）静置10分钟。

b. 2-8°C，10000g离心10分钟。离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底会出现胶状沉淀即为RNA沉淀。

2. RNA洗涤

a. 弃上清。用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，每毫升用于初始裂解的RNAEx ZOL Reagent试剂使用至少1ml 75%乙醇，涡旋混匀后于2-8°C，不超过7500g离心5分钟，弃上清

3. 溶解RNA

a. 在上述过程结束后，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟，不要真空离心离心干燥RNA）。重要的是不要让RNA沉淀过于干燥，这将大大降低其溶解度。加入25-200μl无RNase水或0.5% SDS，用吸头吹打几次至溶解，于50-60°C放置10分钟使RNA彻底溶解（注：若后续进行酶学实验，请勿使用0.5% SDS溶液溶解）。溶解后置于-80°C保存。

DNA分离提取步骤：

1. DNA沉淀

a. 样品加入氯仿分层后，移去上层水相提取RNA，吸取中间层和有机层的DNA用乙醇沉淀。每使用1ml RNAEx ZOL Reagent加入0.3ml 无水乙醇混匀，室温静置2-3分钟，2-8°C不超过2000g离心5分钟以沉淀DNA。

2. DNA洗涤

a. 移去苯酚-乙醇上清液（如需要，保存上清用于蛋白质分离，操作见下）。用0.1M的柠檬酸钠溶液（溶于10%乙醇的柠檬酸钠溶液）清洗沉淀的DNA。每毫升用于初始的RNAEx ZOL Reagent试剂添加1ml 溶液。每次清洗时，室温静置30分钟DNA沉淀（间歇混匀），2-8°C 2000g离心5分钟，弃上清。重复一次。

b. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每使用1ml RNAEx ZOL Reagent加入1.5-2ml 75%乙醇，室温放置10-20分钟（间歇混匀），2-8°C 2000g离心5分钟，弃上清。

c. 室温放置晾干DNA 5-15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50-70mg组织或10⁷细胞中分离的DNA溶于300-600μl 8mM的NaOH溶液中，浓度常为0.2-0.3μg/μl。

注：提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mM NaOH的pH值为9，NaOH溶液溶解后可用TE、HEPES调节PH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可用>12000g离心10分钟除去。

蛋白质分离操作步骤：

1. 蛋白质沉淀

a. 苯酚-乙醇上清液（每1ml RNAEx ZOL Reagent试剂上清体积约0.8ml）中加入异丙醇可沉淀出蛋白质。每毫升用于初始裂解RNAEx ZOL Reagent试剂中添加1.5ml 异丙醇，室温静置10分钟，然后2-8°C 12000g离心10分钟以沉淀蛋白质，弃上清。

2. 蛋白质洗涤

a. 用0.3M盐酸胍溶液（溶于95%乙醇）洗涤蛋白质沉淀3次。每毫升用于初始裂解的RNAEx ZOL Reagent试剂中添加2ml  0.3M盐酸胍溶液。每次洗涤中，室温静置20分钟，2-8°C 7500g离心5分钟，弃上清，重复3次。最后清洗后，加入2ml无水乙醇，漩涡混匀蛋白沉淀，室温静置20分钟，然后2-8°C 7500g离心5分钟以沉淀蛋白质，弃上清。

3. 蛋白质溶解

a. 干空干燥蛋白质沉淀5-10分钟，用1% SDS溶解蛋白质，反复吹打，50°C温浴至完全溶解，不溶物2-8°C 10000g离心10分钟去除。分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或者-20°C保存（长期保存建议-80°C）

【注意事项】

1. RNA 酶污染注意事项：

a. 提取过程用品均经过去RNA酶处理：玻璃制品可以150 °C烘烤4小时 ，塑料制品可浸泡于0.5M NaOH溶液后用清水冲洗并高压灭菌，吸头及离心管类尽量使用一次性无酶吸头及离心管

b. 佩戴手套及口罩及护目镜：皮肤上常含有细菌和霉菌，可污染RNA制备，且同时是RNA酶来源，同时RNAEx ZOL Reagent对皮肤有一定毒性，建议佩戴手套及口罩及护目镜。

c. 尽量于通风橱内提取：避免吸入提取过程中有毒物质。

2. 安全性问题：

a. 本品在与皮肤接触及吞咽有毒性，可导致烧伤。与皮肤接触后，应立即用洗涤剂和大量水冲洗。如感到身体不适，应立即就医

3. 存储性问题：

a. 实验已证明RNAEx ZOL Reagent室温下可稳定保存12个月，不过依然建议储存于2-8°C以保证最佳性能，尽量避光保存。