【保存条件】-4℃保存，有效期6个月；-20℃保存，有效期1年。【概述】天然膜蛋白提取试剂盒为从各种哺乳动物样本中分离天然结构膜蛋白而设计，使用非变性条件为整体膜和膜相关蛋白提供3-5倍的富集。易于使用，允许从哺乳动物样本中快速、稳健地两步提取膜蛋白。为粘附组织培养细胞、悬浮生长组织培养细胞、冷冻细胞颗粒和组织提供了优化的协议。提供的温和、非变性条件使膜蛋白处于非变性、功能状态，使其特别适合各种特殊的蛋白质组学应用和检测，如酶活性检测，包括激酶检测、非变性凝胶电泳、ELISA检测和整体和膜相关蛋白质的SELDI分析。适用样本包括：粘附组织培养细胞、悬浮生长组织培养细胞、冷冻细胞沉淀、组织。【使用建议】使用前：确保所有缓冲液充分解冻并用涡旋混匀。在提取过程中，Wash Buffer、Extraction Buffer I和II保持在冰上，蛋白酶抑制剂混合液室温解冻。Extraction Buffer I和II使用前加入相应体积蛋白酶抑制剂，现配现用。20×Wash Buffer稀释至1×工作液备用：如取1ml加入19ml水混匀稀释，稀释后冰上备用。A. 从贴壁培养细胞中提取膜蛋白贴壁培养细胞用于从T25培养瓶（3-5×106细胞）中提取细胞单层，作为估计起始材料数量的指南，大约从骨肉瘤或肝癌细胞中提取0.4-2mg的膜蛋白，不同的细胞可能会产生相当不同的蛋白质量。 1. 小心地去除培养基，不干扰细胞。2. 用2ml冰冷1×Wash Buffer小心地加入覆盖细胞单层来清洗细胞。轻轻旋转细胞培养瓶，以完全覆盖细胞。3. 吸去1×Wash Buffer，注意不要干扰细胞。4. 重复步骤3和4一次，以去除培养基中的残留物。（如果大量细胞脱落，请将细胞悬液转入离心管，并参考方案B悬浮细胞的步骤5继续操作。）5. 在细胞容器中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制剂）。轻轻摇晃培养瓶使其均匀混合，不扰动细胞。缓冲液应覆盖所有细胞。于 4°C下孵育10分钟，轻微震荡孵育（若少量细胞脱落，温育后将悬液转入离心管并继续步骤 7）。6. 弃去上清液（含可溶性蛋白），或用移液器小心转移至样品管（不扰动细胞），如需后续分析请放置冰上保存。7. 在细胞容器的壁上缓慢加入1ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制剂），同样方式处理并孵育30分钟（4°C，轻柔摇晃）。 8. 用移液器将上清（富含整体膜和膜相关蛋白质的部分）转移至新管中，避免扰动细胞碎片。注意：蛋白质提取完若当天使用请置于冰上，长期保存建议分装（如100µl）并保存于−20°C 或−80°C。B. 从悬浮生长组织培养细胞和冷冻细胞颗粒中提取膜蛋白 该方案适用于3–5×106悬浮培养细胞（相当于25–50 mg湿重）。例如，从4 × 106人胚肾细胞可提取约0.4 mg膜蛋白。不同的细胞类型可能会产生相当不同数量的蛋白质。若准备冻存细胞沉淀，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后速冻（参见步骤 1–4），若已冻存好细胞取出后操作从步骤5开始。1. 将细胞转移至离心管中，300×g、4°C 离心10分钟，去除上清。2. 用2 ml冰冷1×Wash Buffer轻柔洗涤细胞，颠倒混匀使细胞散开。3. 重复离心，去除上清。4. 重复洗涤步骤3–4，最终完全去除1×Wash Buffer。注意：此处可速冻细胞沉淀保存至−70°C以下。5. 在离心管中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制剂），轻轻吹打以彻底重悬细胞，4°C摇晃孵育10分钟。6. 以16,000×g、4°C离心15分钟。7. 弃上清（含可溶性蛋白）或转移保留。8. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬细胞，4°C 轻柔振荡孵育30分钟。9. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。10. 用移液器转移上清（膜蛋白部分），避免扰动沉淀。C. 从组织中提取膜蛋白该方法适用于25–50mg新鲜或速冻组织。例如35 mg牛肝可提取约2 mg膜蛋白。不同的组织类型可能会产生相当不同数量的蛋白质。组织预处理： 解剖后迅速去除非目标组织（如结缔组织、脂肪、血管），将组织切成约2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速冻（步骤 1–4），若已冻存好细胞取出后操作从步骤5开始。1. 切除非目标组织，组织切片后置入含2 ml冰冷Wash Buffer 的管中。2. 轻轻颠倒混匀，去除血细胞和松散杂质。3. 100×g、4°C离心2分钟，弃上清。4. 重复洗涤步骤3–4，最终完全去除1×Wash Buffer。注意：此处可速冻组织沉淀保存至−70°C以下。5. 将组织（或已冻存组织）置入预冷匀浆器，加入2 ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制剂）。6. 低温匀浆（例如牛肝约需10次研磨，不同设备和样本有偏差），直至不见组织块。避免过度碎裂至细胞完全碎裂。7. 将匀浆转移至预冷离心管，4°C轻柔摇晃孵育10分钟。8. 以16,000×g、4°C 离心15分钟。9. 弃去上清（可溶性蛋白），或保留备用。10. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬组织沉淀，孵育30分钟。11. 再次以16,000×g、4°C 离心15分钟。12. 转移上清（膜蛋白部分）至新离心管中，避免扰动沉淀。【注意事项】1. 高温可能破坏膜蛋白及GPCR结构，尤其是结合脂类的受体可能发生聚集或失活，导致信号弱或smear。煮样时需采用温和条件：加完上样缓冲液后50°C 30分钟处理，不要加热至90-100°C。若膜蛋白有多次跨膜情况如GPCR可选择EK-6020 ProEx G蛋白偶联受体（GPCR）提取和稳定试剂盒。2. 本产品长时间低温存放可能会出现沉淀，可在37ºC水浴约10分钟以充分溶解沉淀。沉淀完全溶解后即可正常使用。3. 为保证最佳的使用效果，请尽量避免过多的反复冻融，可分装后使用。4. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

【保存条件】-4℃保存，有效期6个月；-20℃保存，有效期1年。【概述】天然膜蛋白提取试剂盒为从各种哺乳动物样本中分离天然结构膜蛋白而设计，使用非变性条件为整体膜和膜相关蛋白提供3-5倍的富集。易于使用，允许从哺乳动物样本中快速、稳健地两步提取膜蛋白。为粘附组织培养细胞、悬浮生长组织培养细胞、冷冻细胞颗粒和组织提供了优化的协议。提供的温和、非变性条件使膜蛋白处于非变性、功能状态，使其特别适合各种特殊的蛋白质组学应用和检测，如酶活性检测，包括激酶检测、非变性凝胶电泳、ELISA检测和整体和膜相关蛋白质的SELDI分析。适用样本包括：粘附组织培养细胞、悬浮生长组织培养细胞、冷冻细胞沉淀、组织。【使用建议】使用前：确保所有缓冲液充分解冻并用涡旋混匀。在提取过程中，Wash Buffer、Extraction Buffer I和II保持在冰上，蛋白酶抑制剂混合液室温解冻。Extraction Buffer I和II使用前加入相应体积蛋白酶抑制剂，现配现用。20×Wash Buffer稀释至1×工作液备用：如取1ml加入19ml水混匀稀释，稀释后冰上备用。A. 从贴壁培养细胞中提取膜蛋白贴壁培养细胞用于从T25培养瓶（3-5×106细胞）中提取细胞单层，作为估计起始材料数量的指南，大约从骨肉瘤或肝癌细胞中提取0.4-2mg的膜蛋白，不同的细胞可能会产生相当不同的蛋白质量。 1. 小心地去除培养基，不干扰细胞。2. 用2ml冰冷1×Wash Buffer小心地加入覆盖细胞单层来清洗细胞。轻轻旋转细胞培养瓶，以完全覆盖细胞。3. 吸去1×Wash Buffer，注意不要干扰细胞。4. 重复步骤3和4一次，以去除培养基中的残留物。（如果大量细胞脱落，请将细胞悬液转入离心管，并参考方案B悬浮细胞的步骤5继续操作。）5. 在细胞容器中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制剂）。轻轻摇晃培养瓶使其均匀混合，不扰动细胞。缓冲液应覆盖所有细胞。于 4°C下孵育10分钟，轻微震荡孵育（若少量细胞脱落，温育后将悬液转入离心管并继续步骤 7）。6. 弃去上清液（含可溶性蛋白），或用移液器小心转移至样品管（不扰动细胞），如需后续分析请放置冰上保存。7. 在细胞容器的壁上缓慢加入1ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制剂），同样方式处理并孵育30分钟（4°C，轻柔摇晃）。 8. 用移液器将上清（富含整体膜和膜相关蛋白质的部分）转移至新管中，避免扰动细胞碎片。注意：蛋白质提取完若当天使用请置于冰上，长期保存建议分装（如100µl）并保存于−20°C 或−80°C。B. 从悬浮生长组织培养细胞和冷冻细胞颗粒中提取膜蛋白 该方案适用于3–5×106悬浮培养细胞（相当于25–50 mg湿重）。例如，从4 × 106人胚肾细胞可提取约0.4 mg膜蛋白。不同的细胞类型可能会产生相当不同数量的蛋白质。若准备冻存细胞沉淀，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后速冻（参见步骤 1–4），若已冻存好细胞取出后操作从步骤5开始。1. 将细胞转移至离心管中，300×g、4°C 离心10分钟，去除上清。2. 用2 ml冰冷1×Wash Buffer轻柔洗涤细胞，颠倒混匀使细胞散开。3. 重复离心，去除上清。4. 重复洗涤步骤3–4，最终完全去除1×Wash Buffer。注意：此处可速冻细胞沉淀保存至−70°C以下。5. 在离心管中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制剂），轻轻吹打以彻底重悬细胞，4°C摇晃孵育10分钟。6. 以16,000×g、4°C离心15分钟。7. 弃上清（含可溶性蛋白）或转移保留。8. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬细胞，4°C 轻柔振荡孵育30分钟。9. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。10. 用移液器转移上清（膜蛋白部分），避免扰动沉淀。C. 从组织中提取膜蛋白该方法适用于25–50mg新鲜或速冻组织。例如35 mg牛肝可提取约2 mg膜蛋白。不同的组织类型可能会产生相当不同数量的蛋白质。组织预处理： 解剖后迅速去除非目标组织（如结缔组织、脂肪、血管），将组织切成约2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速冻（步骤 1–4），若已冻存好细胞取出后操作从步骤5开始。1. 切除非目标组织，组织切片后置入含2 ml冰冷Wash Buffer 的管中。2. 轻轻颠倒混匀，去除血细胞和松散杂质。3. 100×g、4°C离心2分钟，弃上清。4. 重复洗涤步骤3–4，最终完全去除1×Wash Buffer。注意：此处可速冻组织沉淀保存至−70°C以下。5. 将组织（或已冻存组织）置入预冷匀浆器，加入2 ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制剂）。6. 低温匀浆（例如牛肝约需10次研磨，不同设备和样本有偏差），直至不见组织块。避免过度碎裂至细胞完全碎裂。7. 将匀浆转移至预冷离心管，4°C轻柔摇晃孵育10分钟。8. 以16,000×g、4°C 离心15分钟。9. 弃去上清（可溶性蛋白），或保留备用。10. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬组织沉淀，孵育30分钟。11. 再次以16,000×g、4°C 离心15分钟。12. 转移上清（膜蛋白部分）至新离心管中，避免扰动沉淀。【注意事项】1. 高温可能破坏膜蛋白及GPCR结构，尤其是结合脂类的受体可能发生聚集或失活，导致信号弱或smear。煮样时需采用温和条件：加完上样缓冲液后50°C 30分钟处理，不要加热至90-100°C。若膜蛋白有多次跨膜情况如GPCR可选择EK-6020 ProEx G蛋白偶联受体（GPCR）提取和稳定试剂盒。2. 本产品长时间低温存放可能会出现沉淀，可在37ºC水浴约10分钟以充分溶解沉淀。沉淀完全溶解后即可正常使用。3. 为保证最佳的使用效果，请尽量避免过多的反复冻融，可分装后使用。4. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

【保存条件】GPCR蛋白提取及稳定剂保存于2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物-20℃保存一年【产品概述】提取后稳定受体的天然和功能形式面临诸多挑战，这使得细胞膜外研究极其困难。本提取试剂可在 1-2 小时内高效地从哺乳动物细胞或组织中提取功能性受体。大多数功能性 GPCR 检测必须在受体提取后立即进行，因为受体活性会随着时间的推移迅速下降。本品主要用于从培养的哺乳动物细胞或组织中提取和稳定G偶联蛋白受体 (GPCR) 及其他膜相关蛋白。该提取试剂将受体封装在经过专门优化的去垢剂胶束中，以确保提取后受体在 4°C 下储存时可保持长达1周的功能，在 -20°C下储存时可保持长达1个月的功能。本品每1ml可用于1×106个细胞或50-100 mg组织的GPCR及各类膜蛋白的提取。【操作方法】使用前：GPCR提取及稳定剂根据用量提前加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，每1ml GPCR蛋白提取及稳定试剂中加入20ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，现配现用。A: 对于贴壁细胞：1. 在培养板上用10-15 mL预冷PBS清洗细胞两次。2. 加入1 mL预冷PBS，用细胞刮刀将细胞从板表面刮掉（或胰酶消化收集细胞，消化后记得及时终止消化）。3. 将 1×106个细胞重悬于1 mL预冷的PBS中。收集细胞悬液，4°C，500 × g 离心5分钟。4. 小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C 下500 × g离心5分钟，弃去上清液。5. 将1 mL预冷的GPCR提取及稳定剂（含抑制剂）加入细胞沉淀中。用移液器上下吹打10-15次充分混匀，然后短暂涡旋以获得均匀的细胞悬液。在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。注意：对于过度表达系统，在此步骤需要进行轻度机械破坏以获得最佳效果（如对于 Expi293 系统，使用 Dounce 均质机或手持式组织研磨机进行均质化可增加活性受体的产量）。6. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。7. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在4°C下保存长达1周或在-20°C下保存长达 1个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。注意：对于悬浮细胞GPCR提取，以 500×g离心5分钟收获1×106个细胞。用10-15 mL冷PBS清洗收获的细胞沉淀物两次，并在 4°C下以500×g离心5分钟。小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C，500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。后进行步骤5及后续步骤。B: 对于组织样本：1. 将50-100 mg 组织置于5 mL离心管中。加入4 mL预冷PBS，短暂涡旋，弃去洗液。2. 转移至 2 mL Dounce匀浆器中，用剪刀将组织剪成小块。加入1 mL预冷GPCR 提取和稳定剂（含抑制剂），匀浆至均匀悬浮（10-15 次）。注意：使用手动组织研磨机进行均质化是可以的，但留意可能会导致起泡，勿使用超声破碎。3. 将匀浆转移到新管中，在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。4. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。5. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在 4°C 下保存长达 1 周或在 -20°C 下保存长达 1 个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。【注意事项】1. 高温可能破坏膜蛋白及GPCR结构，尤其是结合脂类的受体可能发生聚集或失活，导致信号弱或smear。煮样时需采用温和条件：加完上样缓冲液后50°C 30分钟处理，不要加热至90-100°C。2. 多数膜蛋白试剂不能很好用于GPCR的提取，本产品可同时用于GPCR和各类膜蛋白的提取。如加上样缓冲液膜蛋白无法溶解后出现沉淀，可适当超声再加样（若无则不需要）。3. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。

【保存条件】GPCR蛋白提取及稳定剂保存于2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物-20℃保存一年【产品概述】提取后稳定受体的天然和功能形式面临诸多挑战，这使得细胞膜外研究极其困难。本提取试剂可在 1-2 小时内高效地从哺乳动物细胞或组织中提取功能性受体。大多数功能性 GPCR 检测必须在受体提取后立即进行，因为受体活性会随着时间的推移迅速下降。本品主要用于从培养的哺乳动物细胞或组织中提取和稳定G偶联蛋白受体 (GPCR) 及其他膜相关蛋白。该提取试剂将受体封装在经过专门优化的去垢剂胶束中，以确保提取后受体在 4°C 下储存时可保持长达1周的功能，在 -20°C下储存时可保持长达1个月的功能。本品每1ml可用于1×106个细胞或50-100 mg组织的GPCR及各类膜蛋白的提取。【操作方法】使用前：GPCR提取及稳定剂根据用量提前加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，每1ml GPCR蛋白提取及稳定试剂中加入20ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，现配现用。A: 对于贴壁细胞：1. 在培养板上用10-15 mL预冷PBS清洗细胞两次。2. 加入1 mL预冷PBS，用细胞刮刀将细胞从板表面刮掉（或胰酶消化收集细胞，消化后记得及时终止消化）。3. 将 1×106个细胞重悬于1 mL预冷的PBS中。收集细胞悬液，4°C，500 × g 离心5分钟。4. 小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C 下500 × g离心5分钟，弃去上清液。5. 将1 mL预冷的GPCR提取及稳定剂（含抑制剂）加入细胞沉淀中。用移液器上下吹打10-15次充分混匀，然后短暂涡旋以获得均匀的细胞悬液。在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。注意：对于过度表达系统，在此步骤需要进行轻度机械破坏以获得最佳效果（如对于 Expi293 系统，使用 Dounce 均质机或手持式组织研磨机进行均质化可增加活性受体的产量）。6. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。7. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在4°C下保存长达1周或在-20°C下保存长达 1个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。注意：对于悬浮细胞GPCR提取，以 500×g离心5分钟收获1×106个细胞。用10-15 mL冷PBS清洗收获的细胞沉淀物两次，并在 4°C下以500×g离心5分钟。小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C，500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。后进行步骤5及后续步骤。B: 对于组织样本：1. 将50-100 mg 组织置于5 mL离心管中。加入4 mL预冷PBS，短暂涡旋，弃去洗液。2. 转移至 2 mL Dounce匀浆器中，用剪刀将组织剪成小块。加入1 mL预冷GPCR 提取和稳定剂（含抑制剂），匀浆至均匀悬浮（10-15 次）。注意：使用手动组织研磨机进行均质化是可以的，但留意可能会导致起泡，勿使用超声破碎。3. 将匀浆转移到新管中，在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。4. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。5. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在 4°C 下保存长达 1 周或在 -20°C 下保存长达 1 个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。【注意事项】1. 高温可能破坏膜蛋白及GPCR结构，尤其是结合脂类的受体可能发生聚集或失活，导致信号弱或smear。煮样时需采用温和条件：加完上样缓冲液后50°C 30分钟处理，不要加热至90-100°C。2. 多数膜蛋白试剂不能很好用于GPCR的提取，本产品可同时用于GPCR和各类膜蛋白的提取。如加上样缓冲液膜蛋白无法溶解后出现沉淀，可适当超声再加样（若无则不需要）。3. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。

【保存条件】-4℃保存，有效期6个月；-20℃保存，有效期1年。【概述】本品提供了一种比较简单、方便地从 培养细胞或组织中抽提细胞膜蛋白和细胞浆蛋白的方法。抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括线粒体膜、内质 网膜和高尔基体膜等上的膜蛋白。本品从各种哺乳动物样本中分离天然结构膜蛋白而设计，使用非变性条件为整体膜和膜相关蛋白提供3-5倍的富集。本品提供的温和、非变性条件使膜蛋白处于非变性、功能状态，使其特别适合各种特殊的蛋白质组学应用和检测，如酶活性检测，包括激酶检测、非变性凝胶电泳、Western Blot检测、ELISA检测和整体和膜相关蛋白质的SELDI分析。适用样本包括：粘附组织培养细胞、悬浮生长组织培养细胞、冷冻细胞沉淀、组织。【使用建议】使用前：确保所有缓冲液充分解冻并用涡旋混匀。在提取过程中，Wash Buffer、高纯细胞质蛋白提取试剂A和高纯细胞膜蛋白提取试剂B保持在冰上，蛋白酶抑制剂混合液室温解冻。细胞质蛋白提取试剂A和细胞质蛋白提取试剂B使用前加入相应体积蛋白酶抑制剂，现配现用。20×Wash Buffer稀释至1×工作液备用：如取1ml加入19ml水混匀稀释，稀释后冰上备用。I. 从细胞中提取细胞质与细胞膜蛋白该方案适用于5–10×106悬浮培养细胞（相当于50–80 mg湿重）。A: 对于贴壁细胞：用预冷的PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液(0.03%)处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。取2ml离心管收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 对于悬浮细胞：先离心收集细胞，再用预冷的PBS清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。1. 在离心管中加入2ml冰冷高纯细胞质蛋白提取试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂），轻轻吹打以彻底重悬细胞，4°C摇晃孵育10分钟。2. 以16,000×g、4°C离心15分钟。3. 用移液器转移上清（细胞质蛋白）转移至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。4. 往沉淀中加入1 ml冰冷高纯细胞膜蛋白提取试剂B（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬吹打均匀，4°C 轻柔振荡孵育30分钟。5. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。6. 转移上清（细胞膜蛋白）至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。II. 从组织中提取细胞质与细胞膜蛋白该方法适用于50–80mg新鲜或速冻组织。组织预处理： 解剖后迅速去除非目标组织（如结缔组织、脂肪、血管），将组织切成约2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速冻（步骤1–4），若已冻存好组织取出后操作从步骤5开始。1. 切除非目标组织，组织切片后置入含2 ml冰冷1×Wash Buffer 的管中。2. 轻轻颠倒混匀，去除血细胞和松散杂质。3. 100×g、4°C离心2分钟，弃上清。4. 重复洗涤步骤3–4，最终完全去除1×Wash Buffer。注意：此处可速冻组织沉淀保存至−70°C以下。5. 将组织（或已冻存组织）置入预冷匀浆器，加入2 ml冰冷高纯细胞质蛋白提取试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂）。6. 低温匀浆（不同设备和样本匀浆次数有偏差），直至不见组织块。避免过度碎裂至细胞完全碎裂。细胞或组织样品的破碎及破碎效果的鉴定:把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约30-50次，匀浆效果与细胞类型和组织类型相关，不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。 7. 将匀浆转移至预冷离心管，4°C轻柔摇晃孵育10分钟。8. 以16,000×g、4°C 离心15分钟。9. 用移液器转移上清（细胞质蛋白）转移至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。10. 加入1 ml冰冷高纯细胞膜蛋白提取试剂B（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬组织沉淀，孵育30分钟。11. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。12. 转移上清（细胞膜蛋白）至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。【注意事项】1. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。2. 若膜蛋白有多次跨膜情况如GPCR可选择EK-6020 ProEx G蛋白偶联受体（GPCR）提取和稳定试剂盒。3. 为保证最佳的使用效果，请尽量避免过多的反复冻融，可分装后使用。4. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。5. 该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

【保存条件】 -4℃保存，有效期6个月；-20℃保存，有效期1年。 【概述】 本品提供了一种比较简单、方便地从 培养细胞或组织中抽提细胞膜蛋白和细胞浆蛋白的方法。抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括线粒体膜、内质 网膜和高尔基体膜等上的膜蛋白。本品从各种哺乳动物样本中分离天然结构膜蛋白而设计，使用非变性条件为整体膜和膜相关蛋白提供3-5倍的富集。 本品提供的温和、非变性条件使膜蛋白处于非变性、功能状态，使其特别适合各种特殊的蛋白质组学应用和检测，如酶活性检测，包括激酶检测、非变性凝胶电泳、Western Blot检测、ELISA检测和整体和膜相关蛋白质的SELDI分析。适用样本包括：粘附组织培养细胞、悬浮生长组织培养细胞、冷冻细胞沉淀、组织。 【使用建议】 使用前：确保所有缓冲液充分解冻并用涡旋混匀。在提取过程中，Wash Buffer、高纯细胞质蛋白提取试剂A和高纯细胞膜蛋白提取试剂B保持在冰上，蛋白酶抑制剂混合液室温解冻。细胞质蛋白提取试剂A和细胞质蛋白提取试剂B使用前加入相应体积蛋白酶抑制剂，现配现用。 20×Wash Buffer稀释至1×工作液备用：如取1ml加入19ml水混匀稀释，稀释后冰上备用。 I. 从细胞中提取细胞质与细胞膜蛋白 该方案适用于5–10×106悬浮培养细胞（相当于50–80 mg湿重）。 A: 对于贴壁细胞：用预冷的PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液(0.03%)处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。取2ml离心管收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。） B: 对于悬浮细胞：先离心收集细胞，再用预冷的PBS清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。 1. 在离心管中加入2ml冰冷高纯细胞质蛋白提取试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂），轻轻吹打以彻底重悬细胞，4°C摇晃孵育10分钟。 2. 以16,000×g、4°C离心15分钟。 3. 用移液器转移上清（细胞质蛋白）转移至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。 4. 往沉淀中加入1 ml冰冷高纯细胞膜蛋白提取试剂B（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬吹打均匀，4°C 轻柔振荡孵育30分钟。 5. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。 6. 转移上清（细胞膜蛋白）至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。 II. 从组织中提取细胞质与细胞膜蛋白 该方法适用于50–80mg新鲜或速冻组织。 组织预处理： 解剖后迅速去除非目标组织（如结缔组织、脂肪、血管），将组织切成约2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速冻（步骤1–4），若已冻存好组织取出后操作从步骤5开始。 1. 切除非目标组织，组织切片后置入含2 ml冰冷1×Wash Buffer 的管中。 2. 轻轻颠倒混匀，去除血细胞和松散杂质。 3. 100×g、4°C离心2分钟，弃上清。 4. 重复洗涤步骤3–4，最终完全去除1×Wash Buffer。 注意：此处可速冻组织沉淀保存至−70°C以下。 5. 将组织（或已冻存组织）置入预冷匀浆器，加入2 ml冰冷高纯细胞质蛋白提取试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂）。 6. 低温匀浆（不同设备和样本匀浆次数有偏差），直至不见组织块。避免过度碎裂至细胞完全碎裂。 细胞或组织样品的破碎及破碎效果的鉴定:把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约30-50次，匀浆效果与细胞类型和组织类型相关，不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。 7. 将匀浆转移至预冷离心管，4°C轻柔摇晃孵育10分钟。 8. 以16,000×g、4°C 离心15分钟。 9. 用移液器转移上清（细胞质蛋白）转移至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。 10. 加入1 ml冰冷高纯细胞膜蛋白提取试剂B（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬组织沉淀，孵育30分钟。 11. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。 12. 转移上清（细胞膜蛋白）至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。 【注意事项】 1. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2. 若膜蛋白有多次跨膜情况如GPCR可选择EK-6020 ProEx G蛋白偶联受体（GPCR）提取和稳定试剂盒。 3. 为保证最佳的使用效果，请尽量避免过多的反复冻融，可分装后使用。 4. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 5. 该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

【保存条件】-20℃保存一年【操作方法】A: 对于贴壁细胞：用 PBS 洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用 EDTA 溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 对于悬浮细胞：用预冷的 PBS 清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。C: 对于组织：建议先用将组织剪成小块，然后使用匀浆器加入预冷缓冲液 C 匀浆（冰上处理）。注意：手动方法可能适用于某些软组织，例如大脑。1. 从组织/细胞中提取各组分蛋白①使用前在 Buffer C、N、M 中加入蛋白酶抑制剂(磷酸化研究则需同时添加磷酸酶抑制剂，现配现用)。②收集细胞，建议数量量 5-10×10 6个细胞，加入 240μl 移液预冷缓冲液 C（含抑制剂）。如有必要，可以增加使用更多缓冲液 C。不建议降低使用量，因为如果溶液变得太稠，这将影响细胞成分的分离。组织量最小不小于 40mg（每 g组织加入约 2ml 预冷缓冲液 C），太小的组织蛋白提取出来后浓度过低。③通过涡旋使细胞充分分散，持续 20 秒或至细胞完全分散。若细胞贴壁过紧无法涡旋分散则用移液器吹打至均匀，组织则加入缓冲液 C 后低温匀浆至完全均质化。④在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。⑤将混合物在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。吸出上清液并将其保存到另一个干净离心管中，上清液即为细胞质蛋白。沉淀包含膜、细胞核部分，放在冰上继续后续操作。离心转速越高越利于分离，离心时间亦可延长至 20 分钟。⑥加入 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。每克组织加入 1.5ml 预冷缓冲液 C 清洗。⑦在 4°C 下孵育混合物 5 分钟（震荡孵育有助于更好清洗）。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。⑧在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞质蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。⑨向沉淀中加入 100μl 预冷缓冲液 N，并从上一步骤中重悬沉淀。⑩在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。11.在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，核蛋白位于该上清液中。剩余含膜蛋白沉淀离心管放在冰上，继续下游操作。12. 用每克组织 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。13. 在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞核蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。14. 向沉淀中加入每克组织 100μl 预冷缓冲液 M 并重悬。15. 在 4°C 下摇床震荡轻轻混合混合物 20 分钟（可增加超声 10 秒促溶解）。建议增加超声过程有助于膜蛋白的溶解，10 秒每次，可多次超声。16. 在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，膜蛋白位于该上清液中。【注意事项】1. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】-20℃保存一年【操作方法】A: 对于贴壁细胞：用 PBS 洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用 EDTA 溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 对于悬浮细胞：用预冷的 PBS 清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。C: 对于组织：建议先用将组织剪成小块，然后使用匀浆器加入预冷缓冲液 C 匀浆（冰上处理）。注意：手动方法可能适用于某些软组织，例如大脑。1. 从组织/细胞中提取各组分蛋白①使用前在 Buffer C、N、M 中加入蛋白酶抑制剂(磷酸化研究则需同时添加磷酸酶抑制剂，现配现用)。②收集细胞，建议数量量 5-10×106个细胞，加入 240μl 移液预冷缓冲液 C（含抑制剂）。如有必要，可以增加使用更多缓冲液 C。不建议降低使用量，因为如果溶液变得太稠，这将影响细胞成分的分离。组织量最小不小于 40mg（每 g组织加入约 2ml 预冷缓冲液 C），太小的组织蛋白提取出来后浓度过低。③通过涡旋使细胞充分分散，持续 20 秒或至细胞完全分散。若细胞贴壁过紧无法涡旋分散则用移液器吹打至均匀，组织则加入缓冲液 C 后低温匀浆至完全均质化。④在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。⑤将混合物在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。吸出上清液并将其保存到另一个干净离心管中，上清液即为细胞质蛋白。沉淀包含膜、细胞核部分，放在冰上继续后续操作。离心转速越高越利于分离，离心时间亦可延长至 20 分钟。⑥加入 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。每克组织加入 1.5ml 预冷缓冲液 C 清洗。⑦在 4°C 下孵育混合物 5 分钟（震荡孵育有助于更好清洗）。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。⑧在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞质蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。⑨向沉淀中加入 100μl 预冷缓冲液 N，并从上一步骤中重悬沉淀。⑩在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。11.在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，核蛋白位于该上清液中。剩余含膜蛋白沉淀离心管放在冰上，继续下游操作。12. 用每克组织 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。13. 在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞核蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。14. 向沉淀中加入每克组织 100μl 预冷缓冲液 M 并重悬。15. 在 4°C 下摇床震荡轻轻混合混合物 20 分钟（可增加超声 10 秒促溶解）。建议增加超声过程有助于膜蛋白的溶解，10 秒每次，可多次超声。16. 在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，膜蛋白位于该上清液中。【注意事项】1. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】4℃保存，有效期 1 年【概述】考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由 465nm 变为 595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值 A595 与蛋白质浓度成正比。本试剂盒和常规的 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒相比可以兼容一系列常见的去垢剂，和 BCA 法相比，能兼容高浓度的还原剂，并且检测速度极快，在检测含去垢剂样品蛋白浓度时，比 BCA 法更加便捷。生命科学研究中的很多蛋白样品都是含有去垢剂的，因此常规Bradford 法的使用受到了很大的限制，通常只能使用可以兼容去垢剂但检测比较耗时的 BCA法。如果使用本试剂盒，不仅 能兼容去垢剂，而且由于能立即显色，检测速度会比 BCA 法快很多。当蛋白样品中同时含有一定浓度的去垢剂和还原剂时，常规的 Bradford 法和 BCA法就都不能使用了，而本试剂盒仍然是可以检测的。本试剂盒测定蛋白浓度时不受较高浓度去垢剂的影响，可以很好地兼容 1% Triton X-100、1% Tween 20、1% SDS、1% NP-40 和 1% Brij35 等去垢剂。本试剂盒检测灵敏度高，最小蛋白检测量达到 0.5μg。【使用方法】1. 蛋白标准液的准备a. 蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，如果蛋白样品所在溶液不含有干扰本试剂盒检测的物质，也可以用 0.9%NaCl、PBS 或水稀释标准品。蛋白标准液(20mg/ml BSA)如果冻存，请完全融化并混匀后使用。b. 按照下表配制 0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5mg/ml 蛋白标准。每次稀释时注意充分混匀。如果有必要可以增加设置 0.0625mg/ml 的蛋白标准。2. 蛋白浓度测定a. 取 10µl 不同浓度蛋白标准加到 96 孔板的蛋白标准孔中。b. 取 10µl 样品到 96 孔板的样品孔中。如果样品不足 10µl，需加标准品稀释液补足到 10µl。请注意记录样品体积。c. 各孔加入 250µl G250 染色液。d. 用酶标仪测定 A595，或 560-610nm 之间的其它波长的吸光度。可以立即测定吸光度，也可以在最长 2 小时内测定，一般来说 2 小时内检测数据无显著变化。e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。【注意事项】1. 本品 BSA 因每次使用量较小，推荐分装使用。2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

AO/PI双染色试剂盒使用说明书 【包装规格】 产品编号 产品名称 包装 EK-5807 AO/PI Staining Kit 100T/500T 使用说明书 1份 【试剂盒组成】 产品编号 产品名称 100T 500T EK-5807A AO染色液 0.5ml 2.5ml EK-5807B PI 染色液 1ml 5ml EK-5801C 10×染色缓冲液 10ml 50ml 【保存条件】 4℃避光保存有效期6个月，-20℃避光保存有效期12个月 【概述】 吖啶橙（Acridine Orange，AO）为一种荧光染料，该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。其激发波长为488nm，吸收波长为515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，复合物可发出不同颜色的荧光，红色荧光为AO-DNA(F>600nm)，绿色荧光为AO-RNA或单链DNA(F>530nm)。在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。 Propidium Iodide是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。因此，在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，早期凋亡细胞呈微弱红光，晚期凋亡细胞红光加强，坏死细胞呈强红色荧光。 【使用方法（仅供参考）】 1. 染色缓冲液及工作液的配制： ①　根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。取100μL10×染色缓冲液加900μL无菌去离子水稀释，混匀即成1×染色缓冲液。 ①　每500μL1×染色缓冲液加入5μL AO染色液和10μL PI染色液，充分混匀，即成染色工作液。 注：不同细胞样本的染色浓度和时间有差异，可以根据预实验结果调整染色液浓度。以上条件适合大多数细胞样本。 2. 悬浮细胞染色 ①　收集样本细胞，细胞数量在10×105个以内。 ②　用PBS洗涤细胞两次。 ③　用500μL染色工作液将细胞重悬。 ④　轻轻混匀后4℃避光孵育10～20分钟。 ⑤　用PBS洗涤细胞。 ⑥　用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。 3. 贴壁细胞原位染色 ①　用PBS洗涤细胞两次。 ②　注意洗细胞过程不要丢失细胞，需要离心收集漂浮细胞。 ③　细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。 ④　37℃孵育细胞10～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。（若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。）⑤　吸干染色工作液，用培养基洗培养板或盖玻片2～3次，每次用预热的培养基覆盖所有细胞，然后吸干培养基。 4. 结果分析： ①　在荧光显微镜下，选用488nm激发光镜检： ②　AO染色正常细胞DNA呈均匀黄色或黄绿色，形态结构正常。 ③　当细胞凋亡时，染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染。坏死细胞呈强红色荧光。 【注意事项】 1. 仅用于实验室，不适合农业/家庭/临床用途使用。 2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。