细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒-100T

【保存条件】

-20℃保存，有效期1年

【使用建议（仅供参考）】

1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂CE I/II及细胞核蛋白抽提试剂 NE备用，在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂混合物及PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM（现配现用）。

A: 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）

B: 对于悬浮细胞：用预冷的PBS清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

2. 每20µL细胞沉淀加入200µL添加了PMSF和蛋白酶抑制剂的细胞浆蛋白抽提试剂CE I。（对于200万HeLa细胞，其细胞沉淀的体积大约为20µL或40mg。)

3. 最高速剧烈涡旋5-10秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长涡旋时间。)

4. 冰浴10-15分钟。（过程中可适当涡旋2-3次）

5. 加入细胞浆蛋白抽提试剂CE II 10µL。最高速剧烈涡旋5秒，冰浴1分钟。

6. 4℃下12,000-16,000g转速离心5分钟。

7. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。每200万细胞用200µL本产品中的细胞浆蛋白抽提试剂CE I裂解后可获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为2-5mg/ml，不同细胞有所不同。)

8. 对于沉淀，完全吸尽残余的上清后，加入50µL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂NE。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。若无法吸尽可使用PBS重悬高速离心后再吸弃上清进行裂解操作。)

9. 将沉淀重悬并在冰上孵育10分钟（过程中可适当涡旋3-5次）。

10. 4℃下12,000-16,000g转速离心10分钟。

12. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-80℃冻存。每200万细胞用50µL本产品中的细胞核蛋白抽提试剂裂解后获得的上清，其细胞核蛋白浓度约为1.2-3.0mg/ml，不同细胞有所不同。

另：新鲜组织细胞核与细胞质蛋白提取

①　把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂CE I和CE II(例如200µL细胞浆蛋白抽提试剂CE I中加入10µL抽提试剂CEII)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200µL组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液(对于不超过30mg的组织样品，仅需加入100µL组织匀浆液)，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。

②　匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。 

③　4℃条件下1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)

④　对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照上一个细胞核质蛋白使用说明的步骤3开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤3至步骤12抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白(特别说明:对于起始量为30-60mg的组织样品，后续直接按照步骤3-12操作即可;对于起始量不超过30mg的组织样品，后续步骤3-12中的溶液的用量须减半使用)。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤13中抽提得到的细胞浆蛋白合并。新鲜的肝脏组织用本产品裂解后获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为3-10mg/ml，细胞核蛋白浓度约为3-10mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。

【注意事项】

1. PMSF及蛋白酶抑制剂现配现用，配好后不能长时间储存。

2. 尽量减少反复冻融的次数，以免效率下降。