血清血浆外泌体提取试剂-100ml

【保存条件】

4ºC保存，有效期1年

【概述】

外泌体是含有复杂RNA和蛋白质的小囊泡（30-120 nm），所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体被认为是细胞间的信使，在特定细胞之间传递其效应物或向大分子发出信号，然而它们的形成、组成以及涉及它们的生物学途径仍未完全了解。

【操作方法】

I:  样品准备：

1. 取出血浆样品并置于冰上。如果样品是冷冻的，将样品在25-37°C的温度下水浴解冻直到完全变成液体，然后放在冰上直到下面操作开始。

2. 室温下以2000×g离心血浆样品20分钟以去除细胞和碎片。

3. 在不干扰沉淀的情况下将部分澄清的上清液血浆转移到新离心管中。

4. 在室温条件下将新离心管以 10,000×g 离心 20 分钟以去除杂质。

5. 将含有澄清血浆的上清液转移到新管中，不要干扰沉淀，并将其置于冰上，直到准备好进行分离

6. 继续步骤“外泌体分离（用蛋白酶处理）”或“外泌体分离（无蛋白酶处理）”。

IIA:外泌体分离（用蛋白酶处理）：

建议使用蛋白酶 K处理以去除大部分血浆中蛋白质，但它可能导致部分暴露在外泌体表面的蛋白质降解（可能蛋白浓度会降低），若这与您的研究内容有冲突，可选择“分离外泌体（未经蛋白酶处理）操作步骤。

1. 从上一步分离的不含细胞的上清液中取所需体积至新管中，并加入0.5倍体积1×PBS。

2. 将混合溶液彻底涡旋混匀。

3. 向样品中加入 0.05 倍体积的蛋白酶 K。例如：对于100µl起始体积的血浆，加入5µl蛋白酶 K 溶液。

4. 涡旋样品，将溶液试管置于37℃下孵育10分钟。

5. 加入 0.2 倍体积（即总体积=血浆+PBS）的血浆外泌体提取试剂至上述溶液中。

6. 充分混合经蛋白酶 K处理的血浆/血浆外泌体提取试剂混合物通过涡旋或倒置直到溶液均匀。（注意：此时溶液应该会轻微混浊。）

7. 将样品在 2-8°C下孵育30分钟。

8. 孵育后，将样品在室温下以10,000×g离心5分钟。（注意：对于小鼠血浆，在4°C下离心30分钟。）

9. 通过移液器吸出上清液并丢弃，此时外泌体包含在试管底部的颗粒中。

10. （可选步骤）再次以10,000×g转速离心试管30秒收集任何可能残留试剂，小心吸弃任何残留的上清液。

11. 继续“外泌体重悬”步骤

IIB:  外泌体分离（无蛋白酶处理）：

1. 从上一步分离的不含细胞的上清液中取所需体积至新管中，并加入 0.5 倍体积1×PBS。

2. 将混合溶液彻底涡旋混匀。

3. 加入0.2倍体积（即总体积=血浆+PBS）的血浆外泌体提取试剂至上述溶液中。

4. 充分混合血浆/血浆外泌体提取试剂混合物通过涡旋或吹打直到溶液彻底均匀。（注意：此时溶液应该会轻微混浊。）

5. 将样品在室温下孵育10分钟。

6. 孵育后，将样品在室温下以10,000 × g离心5分钟

7. 通过移液器吸出上清液并丢弃，外泌体包含在试管底部的颗粒中。

8. （可选步骤）再次以 10,000×g 离心管 30 秒收集任何残留试剂，小心吸弃任何残留的上清液

9. 继续“外泌体重悬”步骤

III:  外泌体重悬

1. 将 1×PBS 或类似缓冲液添加到颗粒中并上下涡旋或吸管以重悬外泌体。

2. 当沉淀重新悬浮之后，所得的外泌体即可进行下游分析或通过亲和层析进一步纯化

3. 提纯后的外泌体可在 2-8℃中保存1周或在小于-20℃中长期保存

【注意事项】

1. 血浆分离后尽快进行外泌体分离，保存在 4℃和-80℃都会对产量有一定的影响。

2. 本品仅限用于科研实验