NewZOL LS 总RNA提取试剂(NewZOL LS Reagent)-100ml

【保存条件】

15-25℃保存12个月有效，4℃保存可延期效期至24个月

【操作方法】

I. 样本处理

1. 组织样本处理：用匀浆器或其他类似设备匀化组织样本机械破坏装置，每500μL最多使用50 mg组织NewZOL LS。 对于DNA含量高的组织（例如脾脏），建议使用25 mg组织/ 500μL试剂。

2. 贴壁细胞样本处理：除去细胞培养基，通过向培养皿（直径3.5 cm，10 cm²）中加入至少1 mL NewZOL LS并通过反复吸移来确保完全裂解。（根据培养皿面积而不是细胞数计算试剂量。试剂量不足将导致分离的RNA受到DNA污染。残留的匀浆可以在-20至-80°C下保存至少一年，以备后用。）

3. 悬浮细胞样本处理：沉淀细胞，并通过添加NewZOL LS直接裂解。 每5×10⁶个细胞至少加入500μL NewZOL LS，移液器吹打数次裂解细胞。（添加NewZOL LS之前请勿洗涤细胞，细胞洗涤可能会导致RNA降解。）

4. 液体样本处理：每200μL液体样品中加入500μL NewZOL LS进行均质化和裂解。对于小于200μL的样品体积，请添加500μLNewZOL LS并加水至最终体积为700μL。

5. 富含脂质样本处理：如上所述均质化富含脂质的样品。将样品以12,000×g离心5分钟。 离心后，样品顶部会出现一层脂肪。用移液器吸头尖端刺穿上层，然后将上清液转移到新管中。

II. RNA提取

1. 每使用500μL NewZOL LS的裂解液中加入200μL无RNase的水至裂解液中。剧烈摇动样品15秒钟。在室温下孵育5分钟。（对于包含50 mg组织/ 500μL NewZOL LS的样品，建议在室温下孵育15分钟。）

2. 在室温下以12,000×g离心样品15分钟。含有DNA，蛋白质和多糖的半固体沉淀物形成在试管底部。 RNA仍溶解在上清液中。

3. 将500μL上清液转移至新管中。 勿吸太干净防止污染，在DNA /蛋白质沉淀上方保留一小部分上清液。（含有DNA，蛋白质和多糖的沉淀物占匀浆-水混合物总量的约10％。）

4. 加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀以沉淀RNA，在室温下孵育样品10分钟。

5. 将样品以12,000×g离心10分钟，除去并丢弃上清液。

通常，在管的底部以白色沉淀的形式获得RNA。对于脾脏样品，RNA在试管底部形成凝胶状膜。用乙醇洗涤后，膜变得更可见。

6. 加入500μL 75％ 乙醇（无RNase水配制）洗涤，轻弹管底使沉淀悬浮，上下颠倒混匀。对于较大的试管，按比例添加75% 乙醇溶液。

7. 将沉淀以8,000×g的速度离心3分钟。移液去除沉淀中的乙醇，重复乙醇洗涤步骤一次。静置5-10分钟待乙醇挥发，无需过份干燥成固体，干燥成固体的RNA沉淀不易溶解

8. 将RNA沉淀溶于无RNase的水中，在室温下涡旋3分钟，以实现有效溶解。将得到的RNA进行检测或-65℃长期保存（若需更长时间保存请添加适量RNA Chill（ES-8520））。

【注意事项】

1. 4℃保存时会有沉淀产生为正常现象，使用时需恢复常温至彻底溶解后使用。

2. RNA 酶污染注意事项：

a. 提取过程用品均经过去RNA酶处理：玻璃制品可以150 °C烘烤4小时 ，塑料制品可浸泡于0.5M NaOH溶液后用清水冲洗并高压灭菌，吸头及离心管类尽量使用一次性无酶吸头及离心管

b. 佩戴手套及口罩及护目镜：皮肤上常含有细菌和霉菌，可污染RNA制备，且同时是RNA酶来源，同时New ZOL LS对皮肤有一定毒性，建议佩戴手套及口罩及护目镜。

c. 尽量于通风橱内提取：避免吸入提取过程中有毒物质。

3. 安全性问题：

a. 本品在与皮肤接触及吞咽有毒性，可导致烧伤。与皮肤接触后，应立即用洗涤剂和大量水冲洗。如感到身体不适，应立即就医