细胞/组织核蛋白提取试剂盒-50T

【保存条件】

4℃保存3个月，-20℃保存一年

【使用建议（仅供参考）】

10×裂解缓冲液LBH稀释：用无菌去离子水稀释10倍，如取1ml的10×裂解缓冲液LBH加入9ml去离子水即得1×裂解缓冲液LBH（使用前添加相应蛋白酶抑制剂）。

哺乳动物细胞核蛋白提取：

1. 细胞收集（10⁶–10⁷个）：

对于贴壁细胞（70-90%汇合单层培养）：从细胞中取出生长培养基后用PBS冲洗细胞两次（注意不要冲洗过于用力造成细胞脱落），吸去PBS，使用胰酶消化或刮刀（使用新鲜PBS）将细胞刮入适当的锥形离心管中。以450×g离心5分钟，倒出并弃去上清液以收集细胞沉淀备用（若使用胰酶消化则需用PBS重复清洗离心1-2次尽可能将胰酶去除）。

对于悬浮细胞：将细胞收集到适当的锥形离心管中以450×g离心5分钟，倒出并弃去上清液，用PBS洗涤细胞1-2次，将细胞沉淀重悬于PBS中。以450×g离心5分钟，倒出并弃去上清液以收集细胞沉淀备用。

1. 将收集的细胞中加入500μL 1×裂解缓冲液LBH（使用前添加相应蛋白酶抑制剂）并在冰上孵育15分钟，让细胞膨胀破裂。

2. 后在裂解缓冲液中加入裂解缓冲液CA 30μL（每100μL混合物加入6μL），剧烈涡旋10秒钟。

3. 在4℃下以10,000–11,000×g立即离心30-60秒。

4. 将上清液转移到新鲜管中，上清液为是细胞质部分，沉淀为细胞核部分。

5. 将粗核沉淀重新悬浮在50μl完整的提取缓冲液EXB中，在冰上放置30分钟裂解，后涡旋10分钟。

6. 在4℃下以14000×g离心30分钟。

7. 转移上清液即细胞核蛋白至新的离心管中，–80°C或者液氮中保存蛋白或直接进行后续实验。

从 100 mg 组织中提取核蛋白：

1. 准备1×裂解缓冲液LBH（如前所述，使用前加入相应蛋白酶抑制剂）

2. 用PBS缓冲液冲洗组织两次，丢弃PBS。

3. 将组织轻轻重悬于1,000μL的1×裂解缓冲液LBH（裂解液使用前加入相应蛋白酶抑制剂）中。

4. 低温匀浆组织直到>90%的细胞破碎，细胞核在显微镜下可视化。

5. 在4℃下将破碎的细胞以10,000-11,000×g离心20分钟。

6. 转移上清液到新鲜管，该部分是细胞质部分。

7. 将粗核沉淀重新悬浮在50μl完整的提取缓冲液EXB中，在冰上放置30分钟裂解，后涡旋10分钟。

8. 在4℃下以14000×g离心30分钟。

9. 转移上清液即细胞核蛋白至新的离心管中，–80°C或者液氮中保存蛋白或直接进行后续实验。

【注意事项】

1. 尽量减少反复冻融的次数，以免效率下降。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作