细胞/组织线粒体提取试剂盒-50T

【保存条件】

4℃保存3个月，-20℃保存一年

【使用建议（仅供参考）】

选项A：使用基于试剂的方法分离线粒体

1. 使用前立即添加蛋白酶抑制剂至试剂A和试剂C中;仅将抑制剂添加到用于实验的试剂量中，而不是添加到储备溶液中。

2. 在2.0mL微量离心管中以~850×g离心2分钟收获沉淀2×10⁷个细胞，小心地取出并丢弃上清液。

3. 加入800μL线粒体分离试剂A，以中速涡旋5秒，并将试管在冰上孵育2分钟。

注意：孵育时间不要超过 2 分钟以避免损害线粒体完整性。

4. 加入10μL线粒体分离试剂B，以最大速度涡旋5秒。

5. 将试管在冰上孵育5分钟，孵育过程中每分钟以最大速度涡旋数秒。

6. 加入800μL线粒体分离试剂C倒置试管数次混合（不要涡旋）。

7. 将离心管在4°C下以700×g离心管离心10分钟。

8. 将上清液转移到新的2.0 mL离心管中，并在4°C下以12,000×g离心15分钟。

注意：如需获得更纯的线粒体部分，减少>50%溶酶体和过氧化物酶体污染物，更改为以3000×g离心15分钟。

9. 将上清液（胞质部分）转移到新管中，沉淀含有分离的线粒体。

10. 向沉淀中加入 500μL线粒体分离试剂C，然后以12,000×g离心5分钟，弃去上清液，沉淀即为纯化后得到的线粒体。

11. 在下游处理之前将线粒体沉淀保持在冰上。冻融可能会损害线粒体的完整性。

选项B：50-200mg组织分离线粒体

1. 取50-200mg组织在PBS溶液中切碎，使用匀浆机中破碎以破碎组织关联，应减少细胞破裂。

注意：如组织较硬如心脏组织，可50-200毫克的硬组织（心脏）在含有0.3毫克/毫升胰蛋白酶的PBS溶液中切成小块，并在冰上孵化三分钟。孵育后，样品在4°C的温度下以700×g离心一分钟。然后仔细丢弃上清液，并收集组织颗粒。添加800微升含有4毫克/毫升BSA的PBS溶液，并使用Polytron或Dounce均质器研磨组织样品，以破坏组织关联。

2. 组织匀质物在4°C下以1000×g离心3分钟，小心地取出并丢弃上清液。

3. 加入800μL线粒体分离试剂A（可加入适量BSA至终浓度为4mg/ml），以中速涡旋5秒，并将试管在冰上孵育2分钟。

注意：孵育时间不要超过 2 分钟以避免损害线粒体完整性。

4. 加入10μL线粒体分离试剂B，以最大速度涡旋5秒。

5. 将试管在冰上孵育5分钟，孵育过程中每分钟以最大速度涡旋数秒。

6. 加入800μL线粒体分离试剂C倒置试管数次混合（不要涡旋）。

7. 将离心管在4°C下以700×g离心管离心10分钟。

8. 将上清液转移到新的2.0 mL离心管中，并在4°C下以12,000×g离心15分钟。

注意：如需获得更纯的线粒体部分，减少>50%溶酶体和过氧化物酶体污染物，更改为以3000×g离心15分钟。

9. 将上清液（胞质部分）转移到新管中，沉淀含有分离的线粒体。

10. 向沉淀中加入 500μL线粒体分离试剂C，然后以12,000×g离心5分钟，弃去上清液，沉淀即为纯化后得到的线粒体。

11. 在下游处理之前将线粒体沉淀保持在冰上。冻融可能会损害线粒体的完整性。

【注意事项】

1. 尽量减少反复冻融的次数，以免效率下降。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作