AO/PI双染色试剂盒-500T

AO/PI双染色试剂盒使用说明书

【包装规格】

【试剂盒组成】

【保存条件】

4℃避光保存有效期6个月，-20℃避光保存有效期12个月

【概述】

吖啶橙（Acridine Orange，AO）为一种荧光染料，该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。其激发波长为488nm，吸收波长为515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，复合物可发出不同颜色的荧光，红色荧光为AO-DNA(F>600nm)，绿色荧光为AO-RNA或单链DNA(F>530nm)。在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。  

Propidium Iodide是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。因此，在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，早期凋亡细胞呈微弱红光，晚期凋亡细胞红光加强，坏死细胞呈强红色荧光。

【使用方法（仅供参考）】

1. 染色缓冲液及工作液的配制：

①　根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。取100μL10×染色缓冲液加900μL无菌去离子水稀释，混匀即成1×染色缓冲液。

①　每500μL1×染色缓冲液加入5μL AO染色液和10μL PI染色液，充分混匀，即成染色工作液。

注：不同细胞样本的染色浓度和时间有差异，可以根据预实验结果调整染色液浓度。以上条件适合大多数细胞样本。

2. 悬浮细胞染色

①　收集样本细胞，细胞数量在10×105个以内。

②　用PBS洗涤细胞两次。

③　用500μL染色工作液将细胞重悬。

④　轻轻混匀后4℃避光孵育10～20分钟。

⑤　用PBS洗涤细胞。

⑥　用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。

3. 贴壁细胞原位染色

①　用PBS洗涤细胞两次。

②　注意洗细胞过程不要丢失细胞，需要离心收集漂浮细胞。

③　细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。

④　37℃孵育细胞10～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。（若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。）

⑤　吸干染色工作液，用培养基洗培养板或盖玻片2～3次，每次用预热的培养基覆盖所有细胞，然后吸干培养基。

4. 结果分析：

①　在荧光显微镜下，选用488nm激发光镜检：

②　AO染色正常细胞DNA呈均匀黄色或黄绿色，形态结构正常。

③　当细胞凋亡时，染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染。坏死细胞呈强红色荧光。

【注意事项】

1. 仅用于实验室，不适合农业/家庭/临床用途使用。

2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。