【保存条件】-20℃避光保存，有效期1年。【概述】Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。本品Hoechst 33258染色液可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色，也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。【使用方法】该产品使用时应室温解冻并充分摇匀。1. 对于固定的细胞或组织：a. 对于细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst 33258染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的Hoechst 33258染色。b. 对于贴壁细胞或组织切片，加入少量Hoechst 33258染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5分钟。c. 吸除Hoechst 33258染色液，用PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。d. 直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。2. 对于活细胞或培养的组织：a. 加入适当量Hoechst 33258染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于6孔板一个孔需加入1ml 染色液，对于96孔板一个孔需加入100微升染色液。b. 在适宜于细胞培养的温度培养20-30分钟。弃染色液，用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。细胞发生凋亡时，在荧光显微镜下观察会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。【注意事项】1. 本品为进口原料配制，成像与稳定效果更佳。2. Hoechst 33258对人体有害，请注意适当防护。3. 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。4. 为减缓荧光淬灭可以使用ES-8312抗荧光淬灭封片剂。5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】-20℃避光保存，有效期1年。【概述】Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。本品Hoechst 33258染色液可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色，也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。【使用方法】该产品使用时应室温解冻并充分摇匀。1. 对于固定的细胞或组织：a. 对于细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst 33258染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的Hoechst 33258染色。b. 对于贴壁细胞或组织切片，加入少量Hoechst 33258染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5分钟。c. 吸除Hoechst 33258染色液，用PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。d. 直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。2. 对于活细胞或培养的组织：a. 加入适当量Hoechst 33258染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于6孔板一个孔需加入1ml 染色液，对于96孔板一个孔需加入100微升染色液。b. 在适宜于细胞培养的温度培养20-30分钟。弃染色液，用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。细胞发生凋亡时，在荧光显微镜下观察会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。【注意事项】1. 本品为进口原料配制，成像与稳定效果更佳。2. Hoechst 33258对人体有害，请注意适当防护。3. 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。4. 为减缓荧光淬灭可以使用ES-8312抗荧光淬灭封片剂。5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】GPCR蛋白提取及稳定剂保存于2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物-20℃保存一年【产品概述】提取后稳定受体的天然和功能形式面临诸多挑战，这使得细胞膜外研究极其困难。本提取试剂可在 1-2 小时内高效地从哺乳动物细胞或组织中提取功能性受体。大多数功能性 GPCR 检测必须在受体提取后立即进行，因为受体活性会随着时间的推移迅速下降。本品主要用于从培养的哺乳动物细胞或组织中提取和稳定G偶联蛋白受体 (GPCR) 及其他膜相关蛋白。该提取试剂将受体封装在经过专门优化的去垢剂胶束中，以确保提取后受体在 4°C 下储存时可保持长达1周的功能，在 -20°C下储存时可保持长达1个月的功能。本品每1ml可用于1×106个细胞或50-100 mg组织的GPCR及各类膜蛋白的提取。【操作方法】使用前：GPCR提取及稳定剂根据用量提前加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，每1ml GPCR蛋白提取及稳定试剂中加入20ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，现配现用。A: 对于贴壁细胞：1. 在培养板上用10-15 mL预冷PBS清洗细胞两次。2. 加入1 mL预冷PBS，用细胞刮刀将细胞从板表面刮掉（或胰酶消化收集细胞，消化后记得及时终止消化）。3. 将 1×106个细胞重悬于1 mL预冷的PBS中。收集细胞悬液，4°C，500 × g 离心5分钟。4. 小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C 下500 × g离心5分钟，弃去上清液。5. 将1 mL预冷的GPCR提取及稳定剂（含抑制剂）加入细胞沉淀中。用移液器上下吹打10-15次充分混匀，然后短暂涡旋以获得均匀的细胞悬液。在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。注意：对于过度表达系统，在此步骤需要进行轻度机械破坏以获得最佳效果（如对于 Expi293 系统，使用 Dounce 均质机或手持式组织研磨机进行均质化可增加活性受体的产量）。6. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。7. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在4°C下保存长达1周或在-20°C下保存长达 1个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。注意：对于悬浮细胞GPCR提取，以 500×g离心5分钟收获1×106个细胞。用10-15 mL冷PBS清洗收获的细胞沉淀物两次，并在 4°C下以500×g离心5分钟。小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C，500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。后进行步骤5及后续步骤。B: 对于组织样本：1. 将50-100 mg 组织置于5 mL离心管中。加入4 mL预冷PBS，短暂涡旋，弃去洗液。2. 转移至 2 mL Dounce匀浆器中，用剪刀将组织剪成小块。加入1 mL预冷GPCR 提取和稳定剂（含抑制剂），匀浆至均匀悬浮（10-15 次）。注意：使用手动组织研磨机进行均质化是可以的，但留意可能会导致起泡，勿使用超声破碎。3. 将匀浆转移到新管中，在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。4. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。5. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在 4°C 下保存长达 1 周或在 -20°C 下保存长达 1 个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。【注意事项】1. 高温可能破坏膜蛋白及GPCR结构，尤其是结合脂类的受体可能发生聚集或失活，导致信号弱或smear。煮样时需采用温和条件：加完上样缓冲液后50°C 30分钟处理，不要加热至90-100°C。2. 多数膜蛋白试剂不能很好用于GPCR的提取，本产品可同时用于GPCR和各类膜蛋白的提取。如加上样缓冲液膜蛋白无法溶解后出现沉淀，可适当超声再加样（若无则不需要）。3. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。

【保存条件】GPCR蛋白提取及稳定剂保存于2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物-20℃保存一年【产品概述】提取后稳定受体的天然和功能形式面临诸多挑战，这使得细胞膜外研究极其困难。本提取试剂可在 1-2 小时内高效地从哺乳动物细胞或组织中提取功能性受体。大多数功能性 GPCR 检测必须在受体提取后立即进行，因为受体活性会随着时间的推移迅速下降。本品主要用于从培养的哺乳动物细胞或组织中提取和稳定G偶联蛋白受体 (GPCR) 及其他膜相关蛋白。该提取试剂将受体封装在经过专门优化的去垢剂胶束中，以确保提取后受体在 4°C 下储存时可保持长达1周的功能，在 -20°C下储存时可保持长达1个月的功能。本品每1ml可用于1×106个细胞或50-100 mg组织的GPCR及各类膜蛋白的提取。【操作方法】使用前：GPCR提取及稳定剂根据用量提前加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，每1ml GPCR蛋白提取及稳定试剂中加入20ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，现配现用。A: 对于贴壁细胞：1. 在培养板上用10-15 mL预冷PBS清洗细胞两次。2. 加入1 mL预冷PBS，用细胞刮刀将细胞从板表面刮掉（或胰酶消化收集细胞，消化后记得及时终止消化）。3. 将 1×106个细胞重悬于1 mL预冷的PBS中。收集细胞悬液，4°C，500 × g 离心5分钟。4. 小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C 下500 × g离心5分钟，弃去上清液。5. 将1 mL预冷的GPCR提取及稳定剂（含抑制剂）加入细胞沉淀中。用移液器上下吹打10-15次充分混匀，然后短暂涡旋以获得均匀的细胞悬液。在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。注意：对于过度表达系统，在此步骤需要进行轻度机械破坏以获得最佳效果（如对于 Expi293 系统，使用 Dounce 均质机或手持式组织研磨机进行均质化可增加活性受体的产量）。6. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。7. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在4°C下保存长达1周或在-20°C下保存长达 1个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。注意：对于悬浮细胞GPCR提取，以 500×g离心5分钟收获1×106个细胞。用10-15 mL冷PBS清洗收获的细胞沉淀物两次，并在 4°C下以500×g离心5分钟。小心吸出并弃去上清液。用1 mL预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。4°C，500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。后进行步骤5及后续步骤。B: 对于组织样本：1. 将50-100 mg 组织置于5 mL离心管中。加入4 mL预冷PBS，短暂涡旋，弃去洗液。2. 转移至 2 mL Dounce匀浆器中，用剪刀将组织剪成小块。加入1 mL预冷GPCR 提取和稳定剂（含抑制剂），匀浆至均匀悬浮（10-15 次）。注意：使用手动组织研磨机进行均质化是可以的，但留意可能会导致起泡，勿使用超声破碎。3. 将匀浆转移到新管中，在 4°C下持续旋转或振荡孵育30分钟充分裂解。4. 将管子在 4°C下以 16,000×g的速度离心20分钟。小心地吸取含有稳定蛋白受体的上清液，并将其转移到新的离心管中。5. 立即进行下游应用或将提取物等分试样储存在 4°C 下保存长达 1 周或在 -20°C 下保存长达 1 个月以备将来使用，同时最大程度地减少受体功能的损失。【注意事项】1. 高温可能破坏膜蛋白及GPCR结构，尤其是结合脂类的受体可能发生聚集或失活，导致信号弱或smear。煮样时需采用温和条件：加完上样缓冲液后50°C 30分钟处理，不要加热至90-100°C。2. 多数膜蛋白试剂不能很好用于GPCR的提取，本产品可同时用于GPCR和各类膜蛋白的提取。如加上样缓冲液膜蛋白无法溶解后出现沉淀，可适当超声再加样（若无则不需要）。3. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。

【保存条件】-4℃保存，有效期6个月；-20℃保存，有效期1年。【概述】本品提供了一种比较简单、方便地从 培养细胞或组织中抽提细胞膜蛋白和细胞浆蛋白的方法。抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括线粒体膜、内质 网膜和高尔基体膜等上的膜蛋白。本品从各种哺乳动物样本中分离天然结构膜蛋白而设计，使用非变性条件为整体膜和膜相关蛋白提供3-5倍的富集。本品提供的温和、非变性条件使膜蛋白处于非变性、功能状态，使其特别适合各种特殊的蛋白质组学应用和检测，如酶活性检测，包括激酶检测、非变性凝胶电泳、Western Blot检测、ELISA检测和整体和膜相关蛋白质的SELDI分析。适用样本包括：粘附组织培养细胞、悬浮生长组织培养细胞、冷冻细胞沉淀、组织。【使用建议】使用前：确保所有缓冲液充分解冻并用涡旋混匀。在提取过程中，Wash Buffer、高纯细胞质蛋白提取试剂A和高纯细胞膜蛋白提取试剂B保持在冰上，蛋白酶抑制剂混合液室温解冻。细胞质蛋白提取试剂A和细胞质蛋白提取试剂B使用前加入相应体积蛋白酶抑制剂，现配现用。20×Wash Buffer稀释至1×工作液备用：如取1ml加入19ml水混匀稀释，稀释后冰上备用。I. 从细胞中提取细胞质与细胞膜蛋白该方案适用于5–10×106悬浮培养细胞（相当于50–80 mg湿重）。A: 对于贴壁细胞：用预冷的PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液(0.03%)处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。取2ml离心管收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 对于悬浮细胞：先离心收集细胞，再用预冷的PBS清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。1. 在离心管中加入2ml冰冷高纯细胞质蛋白提取试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂），轻轻吹打以彻底重悬细胞，4°C摇晃孵育10分钟。2. 以16,000×g、4°C离心15分钟。3. 用移液器转移上清（细胞质蛋白）转移至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。4. 往沉淀中加入1 ml冰冷高纯细胞膜蛋白提取试剂B（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬吹打均匀，4°C 轻柔振荡孵育30分钟。5. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。6. 转移上清（细胞膜蛋白）至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。II. 从组织中提取细胞质与细胞膜蛋白该方法适用于50–80mg新鲜或速冻组织。组织预处理： 解剖后迅速去除非目标组织（如结缔组织、脂肪、血管），将组织切成约2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速冻（步骤1–4），若已冻存好组织取出后操作从步骤5开始。1. 切除非目标组织，组织切片后置入含2 ml冰冷1×Wash Buffer 的管中。2. 轻轻颠倒混匀，去除血细胞和松散杂质。3. 100×g、4°C离心2分钟，弃上清。4. 重复洗涤步骤3–4，最终完全去除1×Wash Buffer。注意：此处可速冻组织沉淀保存至−70°C以下。5. 将组织（或已冻存组织）置入预冷匀浆器，加入2 ml冰冷高纯细胞质蛋白提取试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂）。6. 低温匀浆（不同设备和样本匀浆次数有偏差），直至不见组织块。避免过度碎裂至细胞完全碎裂。细胞或组织样品的破碎及破碎效果的鉴定:把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约30-50次，匀浆效果与细胞类型和组织类型相关，不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。 7. 将匀浆转移至预冷离心管，4°C轻柔摇晃孵育10分钟。8. 以16,000×g、4°C 离心15分钟。9. 用移液器转移上清（细胞质蛋白）转移至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。10. 加入1 ml冰冷高纯细胞膜蛋白提取试剂B（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬组织沉淀，孵育30分钟。11. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。12. 转移上清（细胞膜蛋白）至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。【注意事项】1. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。2. 若膜蛋白有多次跨膜情况如GPCR可选择EK-6020 ProEx G蛋白偶联受体（GPCR）提取和稳定试剂盒。3. 为保证最佳的使用效果，请尽量避免过多的反复冻融，可分装后使用。4. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。5. 该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

【保存条件】 -4℃保存，有效期6个月；-20℃保存，有效期1年。 【概述】 本品提供了一种比较简单、方便地从 培养细胞或组织中抽提细胞膜蛋白和细胞浆蛋白的方法。抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括线粒体膜、内质 网膜和高尔基体膜等上的膜蛋白。本品从各种哺乳动物样本中分离天然结构膜蛋白而设计，使用非变性条件为整体膜和膜相关蛋白提供3-5倍的富集。 本品提供的温和、非变性条件使膜蛋白处于非变性、功能状态，使其特别适合各种特殊的蛋白质组学应用和检测，如酶活性检测，包括激酶检测、非变性凝胶电泳、Western Blot检测、ELISA检测和整体和膜相关蛋白质的SELDI分析。适用样本包括：粘附组织培养细胞、悬浮生长组织培养细胞、冷冻细胞沉淀、组织。 【使用建议】 使用前：确保所有缓冲液充分解冻并用涡旋混匀。在提取过程中，Wash Buffer、高纯细胞质蛋白提取试剂A和高纯细胞膜蛋白提取试剂B保持在冰上，蛋白酶抑制剂混合液室温解冻。细胞质蛋白提取试剂A和细胞质蛋白提取试剂B使用前加入相应体积蛋白酶抑制剂，现配现用。 20×Wash Buffer稀释至1×工作液备用：如取1ml加入19ml水混匀稀释，稀释后冰上备用。 I. 从细胞中提取细胞质与细胞膜蛋白 该方案适用于5–10×106悬浮培养细胞（相当于50–80 mg湿重）。 A: 对于贴壁细胞：用预冷的PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液(0.03%)处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。取2ml离心管收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。） B: 对于悬浮细胞：先离心收集细胞，再用预冷的PBS清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。 1. 在离心管中加入2ml冰冷高纯细胞质蛋白提取试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂），轻轻吹打以彻底重悬细胞，4°C摇晃孵育10分钟。 2. 以16,000×g、4°C离心15分钟。 3. 用移液器转移上清（细胞质蛋白）转移至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。 4. 往沉淀中加入1 ml冰冷高纯细胞膜蛋白提取试剂B（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬吹打均匀，4°C 轻柔振荡孵育30分钟。 5. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。 6. 转移上清（细胞膜蛋白）至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。 II. 从组织中提取细胞质与细胞膜蛋白 该方法适用于50–80mg新鲜或速冻组织。 组织预处理： 解剖后迅速去除非目标组织（如结缔组织、脂肪、血管），将组织切成约2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速冻（步骤1–4），若已冻存好组织取出后操作从步骤5开始。 1. 切除非目标组织，组织切片后置入含2 ml冰冷1×Wash Buffer 的管中。 2. 轻轻颠倒混匀，去除血细胞和松散杂质。 3. 100×g、4°C离心2分钟，弃上清。 4. 重复洗涤步骤3–4，最终完全去除1×Wash Buffer。 注意：此处可速冻组织沉淀保存至−70°C以下。 5. 将组织（或已冻存组织）置入预冷匀浆器，加入2 ml冰冷高纯细胞质蛋白提取试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂）。 6. 低温匀浆（不同设备和样本匀浆次数有偏差），直至不见组织块。避免过度碎裂至细胞完全碎裂。 细胞或组织样品的破碎及破碎效果的鉴定:把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约30-50次，匀浆效果与细胞类型和组织类型相关，不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 通常可以在匀浆30次后取约2-3微升细胞或组织匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。 7. 将匀浆转移至预冷离心管，4°C轻柔摇晃孵育10分钟。 8. 以16,000×g、4°C 离心15分钟。 9. 用移液器转移上清（细胞质蛋白）转移至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。 10. 加入1 ml冰冷高纯细胞膜蛋白提取试剂B（使用前加入蛋白酶抑制剂），彻底重悬组织沉淀，孵育30分钟。 11. 再次以16,000×g、4°C离心15分钟。 12. 转移上清（细胞膜蛋白）至新的离心管中或冻-80℃备用，注意不要扰动沉淀。 【注意事项】 1. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2. 若膜蛋白有多次跨膜情况如GPCR可选择EK-6020 ProEx G蛋白偶联受体（GPCR）提取和稳定试剂盒。 3. 为保证最佳的使用效果，请尽量避免过多的反复冻融，可分装后使用。 4. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 5. 该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

【保存条件】-20℃保存一年【操作方法】A: 对于贴壁细胞：用 PBS 洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用 EDTA 溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 对于悬浮细胞：用预冷的 PBS 清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。C: 对于组织：建议先用将组织剪成小块，然后使用匀浆器加入预冷缓冲液 C 匀浆（冰上处理）。注意：手动方法可能适用于某些软组织，例如大脑。1. 从组织/细胞中提取各组分蛋白①使用前在 Buffer C、N、M 中加入蛋白酶抑制剂(磷酸化研究则需同时添加磷酸酶抑制剂，现配现用)。②收集细胞，建议数量量 5-10×10 6个细胞，加入 240μl 移液预冷缓冲液 C（含抑制剂）。如有必要，可以增加使用更多缓冲液 C。不建议降低使用量，因为如果溶液变得太稠，这将影响细胞成分的分离。组织量最小不小于 40mg（每 g组织加入约 2ml 预冷缓冲液 C），太小的组织蛋白提取出来后浓度过低。③通过涡旋使细胞充分分散，持续 20 秒或至细胞完全分散。若细胞贴壁过紧无法涡旋分散则用移液器吹打至均匀，组织则加入缓冲液 C 后低温匀浆至完全均质化。④在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。⑤将混合物在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。吸出上清液并将其保存到另一个干净离心管中，上清液即为细胞质蛋白。沉淀包含膜、细胞核部分，放在冰上继续后续操作。离心转速越高越利于分离，离心时间亦可延长至 20 分钟。⑥加入 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。每克组织加入 1.5ml 预冷缓冲液 C 清洗。⑦在 4°C 下孵育混合物 5 分钟（震荡孵育有助于更好清洗）。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。⑧在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞质蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。⑨向沉淀中加入 100μl 预冷缓冲液 N，并从上一步骤中重悬沉淀。⑩在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。11.在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，核蛋白位于该上清液中。剩余含膜蛋白沉淀离心管放在冰上，继续下游操作。12. 用每克组织 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。13. 在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞核蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。14. 向沉淀中加入每克组织 100μl 预冷缓冲液 M 并重悬。15. 在 4°C 下摇床震荡轻轻混合混合物 20 分钟（可增加超声 10 秒促溶解）。建议增加超声过程有助于膜蛋白的溶解，10 秒每次，可多次超声。16. 在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，膜蛋白位于该上清液中。【注意事项】1. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】-20℃保存一年【操作方法】A: 对于贴壁细胞：用 PBS 洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用 EDTA 溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 对于悬浮细胞：用预冷的 PBS 清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。C: 对于组织：建议先用将组织剪成小块，然后使用匀浆器加入预冷缓冲液 C 匀浆（冰上处理）。注意：手动方法可能适用于某些软组织，例如大脑。1. 从组织/细胞中提取各组分蛋白①使用前在 Buffer C、N、M 中加入蛋白酶抑制剂(磷酸化研究则需同时添加磷酸酶抑制剂，现配现用)。②收集细胞，建议数量量 5-10×106个细胞，加入 240μl 移液预冷缓冲液 C（含抑制剂）。如有必要，可以增加使用更多缓冲液 C。不建议降低使用量，因为如果溶液变得太稠，这将影响细胞成分的分离。组织量最小不小于 40mg（每 g组织加入约 2ml 预冷缓冲液 C），太小的组织蛋白提取出来后浓度过低。③通过涡旋使细胞充分分散，持续 20 秒或至细胞完全分散。若细胞贴壁过紧无法涡旋分散则用移液器吹打至均匀，组织则加入缓冲液 C 后低温匀浆至完全均质化。④在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。⑤将混合物在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。吸出上清液并将其保存到另一个干净离心管中，上清液即为细胞质蛋白。沉淀包含膜、细胞核部分，放在冰上继续后续操作。离心转速越高越利于分离，离心时间亦可延长至 20 分钟。⑥加入 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。每克组织加入 1.5ml 预冷缓冲液 C 清洗。⑦在 4°C 下孵育混合物 5 分钟（震荡孵育有助于更好清洗）。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。⑧在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞质蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。⑨向沉淀中加入 100μl 预冷缓冲液 N，并从上一步骤中重悬沉淀。⑩在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。11.在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，核蛋白位于该上清液中。剩余含膜蛋白沉淀离心管放在冰上，继续下游操作。12. 用每克组织 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。13. 在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞核蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。14. 向沉淀中加入每克组织 100μl 预冷缓冲液 M 并重悬。15. 在 4°C 下摇床震荡轻轻混合混合物 20 分钟（可增加超声 10 秒促溶解）。建议增加超声过程有助于膜蛋白的溶解，10 秒每次，可多次超声。16. 在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，膜蛋白位于该上清液中。【注意事项】1. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】4℃保存，有效期 1 年【概述】考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由 465nm 变为 595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值 A595 与蛋白质浓度成正比。本试剂盒和常规的 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒相比可以兼容一系列常见的去垢剂，和 BCA 法相比，能兼容高浓度的还原剂，并且检测速度极快，在检测含去垢剂样品蛋白浓度时，比 BCA 法更加便捷。生命科学研究中的很多蛋白样品都是含有去垢剂的，因此常规Bradford 法的使用受到了很大的限制，通常只能使用可以兼容去垢剂但检测比较耗时的 BCA法。如果使用本试剂盒，不仅 能兼容去垢剂，而且由于能立即显色，检测速度会比 BCA 法快很多。当蛋白样品中同时含有一定浓度的去垢剂和还原剂时，常规的 Bradford 法和 BCA法就都不能使用了，而本试剂盒仍然是可以检测的。本试剂盒测定蛋白浓度时不受较高浓度去垢剂的影响，可以很好地兼容 1% Triton X-100、1% Tween 20、1% SDS、1% NP-40 和 1% Brij35 等去垢剂。本试剂盒检测灵敏度高，最小蛋白检测量达到 0.5μg。【使用方法】1. 蛋白标准液的准备a. 蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，如果蛋白样品所在溶液不含有干扰本试剂盒检测的物质，也可以用 0.9%NaCl、PBS 或水稀释标准品。蛋白标准液(20mg/ml BSA)如果冻存，请完全融化并混匀后使用。b. 按照下表配制 0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5mg/ml 蛋白标准。每次稀释时注意充分混匀。如果有必要可以增加设置 0.0625mg/ml 的蛋白标准。2. 蛋白浓度测定a. 取 10µl 不同浓度蛋白标准加到 96 孔板的蛋白标准孔中。b. 取 10µl 样品到 96 孔板的样品孔中。如果样品不足 10µl，需加标准品稀释液补足到 10µl。请注意记录样品体积。c. 各孔加入 250µl G250 染色液。d. 用酶标仪测定 A595，或 560-610nm 之间的其它波长的吸光度。可以立即测定吸光度，也可以在最长 2 小时内测定，一般来说 2 小时内检测数据无显著变化。e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。【注意事项】1. 本品 BSA 因每次使用量较小，推荐分装使用。2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】 -20℃保存,有效期2年 【概述】 0.25%胰酶细胞消化液(含EDTA)含0.25%胰酶、EDTA和酚红，pH值为7.2-7.8。该消化液经过过滤除菌，可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化。 【使用建议（仅供参考）】 1. 贴壁细胞的消化：a.吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。b.加入少量0.25%胰酶细胞消化液(含EDTA)，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。不同的细胞消化时间有所不同。c.显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。d.如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。2. 组织的消化：a.不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。 【注意事项】 1. 胰酶消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。 2. 注意无菌操作，尽量避免污染。 3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。