FasRun Acrylamide Kit（10%）

【保存条件】 -20℃保存，有效期1年 【使用建议（仅供参考）】 1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂CE I/II及细胞核蛋白抽提试剂 NE备用，在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂混合物及PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM（现配现用）。 A: 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。） B: 对于悬浮细胞：用预冷的PBS清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。 2. 每20µL细胞沉淀加入200µL添加了PMSF和蛋白酶抑制剂的细胞浆蛋白抽提试剂CE I。（对于200万HeLa细胞，其细胞沉淀的体积大约为20µL或40mg。) 3. 最高速剧烈涡旋5-10秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长涡旋时间。) 4. 冰浴10-15分钟。（过程中可适当涡旋2-3次） 5. 加入细胞浆蛋白抽提试剂CE II 10µL。最高速剧烈涡旋5秒，冰浴1分钟。 6. 4℃下12,000-16,000g转速离心5分钟。 7. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。每200万细胞用200µL本产品中的细胞浆蛋白抽提试剂CE I裂解后可获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为2-5mg/ml，不同细胞有所不同。) 8. 对于沉淀，完全吸尽残余的上清后，加入50µL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂NE。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。若无法吸尽可使用PBS重悬高速离心后再吸弃上清进行裂解操作。) 9. 将沉淀重悬并在冰上孵育10分钟（过程中可适当涡旋3-5次）。 10. 4℃下12,000-16,000g转速离心10分钟。 12. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-80℃冻存。每200万细胞用50µL本产品中的细胞核蛋白抽提试剂裂解后获得的上清，其细胞核蛋白浓度约为1.2-3.0mg/ml，不同细胞有所不同。 另：新鲜组织细胞核与细胞质蛋白提取 ①　把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂CE I和CE II(例如200µL细胞浆蛋白抽提试剂CE I中加入10µL抽提试剂CEII)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200µL组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液(对于不超过30mg的组织样品，仅需加入100µL组织匀浆液)，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。 ②　匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。 ③　4℃条件下1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。) ④　对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照上一个细胞核质蛋白使用说明的步骤3开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤3至步骤12抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白(特别说明:对于起始量为30-60mg的组织样品，后续直接按照步骤3-12操作即可;对于起始量不超过30mg的组织样品，后续步骤3-12中的溶液的用量须减半使用)。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤13中抽提得到的细胞浆蛋白合并。新鲜的肝脏组织用本产品裂解后获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为3-10mg/ml，细胞核蛋白浓度约为3-10mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。 【注意事项】 1. PMSF及蛋白酶抑制剂现配现用，配好后不能长时间储存。 2. 尽量减少反复冻融的次数，以免效率下降。

【保存条件】 室温（15-30℃）保存一年 【概述】 RNA holder是一种无毒的可直接使用的样品储存液，能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA于原位。可以快速可靠地保存动物组织、细胞内的RNA。组织获取后立即浸入RNA holder保存液中，在室温可以保存7天，4℃可以保存4周，-20℃、-80℃标本可以长期保存，RNA稳定存在不降解，取出后用各类方法抽提可以获得高质量的RNA。 【操作方法】 1. 根据要保存的各样本的体积，计算出所需 RNA holder用量。RNA holder的用量应当是组织体积的 10 倍（如 100mg 组织约用 1ml RNA holder）；离心收集 2×106细胞 RNA holder的用量是1ml。 2. 将 RNA holder按需要量分装入自备保存管中； 3. 快速将较大的组织切成任何一边最大厚度不大于0.5cm大小，然后将组织碎块放入到10倍体积的RNA holder中保存。注：组织过厚则RNA holder不能有效渗入，组织中间部位的RNA不能受到保护。 4. 保存时先将样本浸入RNA holder后置4℃冰箱过夜（使RNA holder完全渗入到组织中），然后转移至-20℃冰箱（RNA holder在-20℃仍为液态，有结晶析出为正常情况），或者过夜取出后直接转移至-80℃，可反复冻融20次不影响RNA质量。 【注意事项】 1. 组织和细胞取材要快速，防止RNA降解。冰冻组织不能用RNA holder保存，因其不能有效渗入冰冻组织中。 2. 保存样品的提取：组织样本从-20℃或-80℃取出后，复苏到室温后，取出组织块置于RNA提取液（如Trizol）中再行提取。细胞样本复温后低速离心收集细胞，去除RNA holder后，再加入RNA提取液提取RNA（细胞样本可直接在RNA holder中提取，需向混合物中加入10倍体积提取液如Trizol）。后续若需匀浆处理可直接在室温进行，不必在液氮中操作，RNA仍能有效得到保护。残留少量RNA holder不影响后续提取质量。

【保存条件】 室温（15-30℃）保存一年 【概述】 RNA holder是一种无毒的可直接使用的样品储存液，能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA于原位。可以快速可靠地保存动物组织、细胞内的RNA。组织获取后立即浸入RNA holder保存液中，在室温可以保存7天，4℃可以保存4周，-20℃、-80℃标本可以长期保存，RNA稳定存在不降解，取出后用各类方法抽提可以获得高质量的RNA。 【操作方法】 1. 根据要保存的各样本的体积，计算出所需 RNA holder用量。RNA holder的用量应当是组织体积的 10 倍（如 100mg 组织约用 1ml RNA holder）；离心收集 2×106细胞 RNA holder的用量是1ml。 2. 将 RNA holder按需要量分装入自备保存管中； 3. 快速将较大的组织切成任何一边最大厚度不大于0.5cm大小，然后将组织碎块放入到10倍体积的RNA holder中保存。注：组织过厚则RNA holder不能有效渗入，组织中间部位的RNA不能受到保护。 4. 保存时先将样本浸入RNA holder后置4℃冰箱过夜（使RNA holder完全渗入到组织中），然后转移至-20℃冰箱（RNA holder在-20℃仍为液态，有结晶析出为正常情况），或者过夜取出后直接转移至-80℃，可反复冻融20次不影响RNA质量。 【注意事项】 1. 组织和细胞取材要快速，防止RNA降解。冰冻组织不能用RNA holder保存，因其不能有效渗入冰冻组织中。 2. 保存样品的提取：组织样本从-20℃或-80℃取出后，复苏到室温后，取出组织块置于RNA提取液（如Trizol）中再行提取。细胞样本复温后低速离心收集细胞，去除RNA holder后，再加入RNA提取液提取RNA（细胞样本可直接在RNA holder中提取，需向混合物中加入10倍体积提取液如Trizol）。后续若需匀浆处理可直接在室温进行，不必在液氮中操作，RNA仍能有效得到保护。残留少量RNA holder不影响后续提取质量。

【操作方法】 1. 样品处理： a. 组织：将组织在液氮中研磨，磨碎后及时于每50-100mg组织中加入1ml RNAEx ZOL Reagent，样品体积不应超过RNAEx ZOL Reagent体积的10%（或使用匀浆仪器）。 b. 单层细胞：直接在培养皿中裂解细胞，如35mm直径的培养皿中加入1ml RNAEx ZOL Reagent，使用吸头吹匀促进细胞裂解。RNAEx ZOL Reagent的试剂量基于培养的表面积而不是细胞数量（每10cm2加入1ml RNAEx ZOL Reagent），RNAEx ZOL Reagent试剂量不足可能会导致分离出的RNA有DNA污染。 c. 悬浮细胞：先低速离心沉淀细胞，弃培养液后加入RNAEx ZOL Reagent（1ml RNAEx ZOL Reagent加入至5×106动物、植物、酵母或细菌细胞中）。加入RNAEx ZOL Reagent前避免洗涤细胞，这容易导致mRNA降解。一些酵母和细菌细胞的裂解可能需要使用均质器。 可选：一些样品可能需要额外的分享步骤，这些样品蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高，如肌肉、脂肪组织、以及部分植物块茎。在根据上述方式处理后，于2-8°C，12000g离心10分钟，移除沉淀不溶物，RNA存于上清中。 2. 相分离 a. 将加完RNAEx ZOL Reagent后的样品在室温（15-30°C）静置5分钟，以利于样品核蛋白体完全分离 b. 按每1ml RNAEx ZOL Reagent加入0.2ml 氯仿（自备），小心盖好样品管后，剧烈震荡15秒，后置于室温（15-30°C）静置2-3分钟。 c. 2-8°C，10000g离心15分钟。离心后，混合物分离为下层（酚-氯仿相）、中间相以及上层无色水相。RNA存在于上层无色水相中，体积约为最初加入RNAEx ZOL Reagent体积的60%左右。 RNA分离提取步骤： 1. RNA沉淀 a. 将上述水相转移到一个新的管中，并保存有机相（若希望分离DNA或蛋白质）。混合异丙醇从水相中沉淀RNA，每1ml 用于初始裂解的RNAEx ZOL Reagent使用0.5ml 异丙醇，室温（15-30°C）静置10分钟。 b. 2-8°C，10000g离心10分钟。离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底会出现胶状沉淀即为RNA沉淀。 2. RNA洗涤 a. 弃上清。用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，每毫升用于初始裂解的RNAEx ZOL Reagent试剂使用至少1ml 75%乙醇，涡旋混匀后于2-8°C，不超过7500g离心5分钟，弃上清 3. 溶解RNAa. 在上述过程结束后，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟，不要真空离心离心干燥RNA）。重要的是不要让RNA沉淀过于干燥，这将大大降低其溶解度。加入25-200μl无RNase水或0.5% SDS，用吸头吹打几次至溶解，于50-60°C放置10分钟使RNA彻底溶解（注：若后续进行酶学实验，请勿使用0.5% SDS溶液溶解）。溶解后置于-80°C保存。 DNA分离提取步骤： 1. DNA沉淀 a. 样品加入氯仿分层后，移去上层水相提取RNA，吸取中间层和有机层的DNA用乙醇沉淀。每使用1ml RNAEx ZOL Reagent加入0.3ml 无水乙醇混匀，室温静置2-3分钟，2-8°C不超过2000g离心5分钟以沉淀DNA。 2. DNA洗涤 a. 移去苯酚-乙醇上清液（如需要，保存上清用于蛋白质分离，操作见下）。用0.1M的柠檬酸钠溶液（溶于10%乙醇的柠檬酸钠溶液）清洗沉淀的DNA。每毫升用于初始的RNAEx ZOL Reagent试剂添加1ml 溶液。每次清洗时，室温静置30分钟DNA沉淀（间歇混匀），2-8°C 2000g离心5分钟，弃上清。重复一次。 b. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每使用1ml RNAEx ZOL Reagent加入1.5-2ml 75%乙醇，室温放置10-20分钟（间歇混匀），2-8°C 2000g离心5分钟，弃上清。 c. 室温放置晾干DNA 5-15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600μl 8mM的NaOH溶液中，浓度常为0.2-0.3μg/μl。 注：提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mM NaOH的pH值为9，NaOH溶液溶解后可用TE、HEPES调节PH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可用>12000g离心10分钟除去。 蛋白质分离操作步骤： 1. 蛋白质沉淀 a. 苯酚-乙醇上清液（每1ml RNAEx ZOL Reagent试剂上清体积约0.8ml）中加入异丙醇可沉淀出蛋白质。每毫升用于初始裂解RNAEx ZOL Reagent试剂中添加1.5ml 异丙醇，室温静置10分钟，然后2-8°C 12000g离心10分钟以沉淀蛋白质，弃上清。 2. 蛋白质洗涤 a. 用0.3M盐酸胍溶液（溶于95%乙醇）洗涤蛋白质沉淀3次。每毫升用于初始裂解的RNAEx ZOL Reagent试剂中添加2ml 0.3M盐酸胍溶液。每次洗涤中，室温静置20分钟，2-8°C 7500g离心5分钟，弃上清，重复3次。最后清洗后，加入2ml无水乙醇，漩涡混匀蛋白沉淀，室温静置20分钟，然后2-8°C 7500g离心5分钟以沉淀蛋白质，弃上清。 3. 蛋白质溶解 a. 干空干燥蛋白质沉淀5-10分钟，用1% SDS溶解蛋白质，反复吹打，50°C温浴至完全溶解，不溶物2-8°C 10000g离心10分钟去除。分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或者-20°C保存（长期保存建议-80°C） 【注意事项】 1. RNA 酶污染注意事项： a. 提取过程用品均经过去RNA酶处理：玻璃制品可以150 °C烘烤4小时 ，塑料制品可浸泡于0.5M NaOH溶液后用清水冲洗并高压灭菌，吸头及离心管类尽量使用一次性无酶吸头及离心管 b. 佩戴手套及口罩及护目镜：皮肤上常含有细菌和霉菌，可污染RNA制备，且同时是RNA酶来源，同时RNAEx ZOL Reagent对皮肤有一定毒性，建议佩戴手套及口罩及护目镜。 c. 尽量于通风橱内提取：避免吸入提取过程中有毒物质。 2. 安全性问题： a. 本品在与皮肤接触及吞咽有毒性，可导致烧伤。与皮肤接触后，应立即用洗涤剂和大量水冲洗。如感到身体不适，应立即就医 3. 存储性问题： a. 实验已证明RNAEx ZOL Reagent室温下可稳定保存12个月，不过依然建议储存于2-8°C以保证最佳性能，尽量避光保存。

【保存条件】 4ºC保存，有效期1年 【概述】 外泌体是含有复杂RNA和蛋白质的小囊泡（30-120 nm），所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体被认为是细胞间的信使，在特定细胞之间传递其效应物或向大分子发出信号，然而它们的形成、组成以及涉及它们的生物学途径仍未完全了解。 【操作方法】 I: 样品准备： 1. 取出血浆样品并置于冰上。如果样品是冷冻的，将样品在25-37°C的温度下水浴解冻直到完全变成液体，然后放在冰上直到下面操作开始。 2. 室温下以2000×g离心血浆样品20分钟以去除细胞和碎片。 3. 在不干扰沉淀的情况下将部分澄清的上清液血浆转移到新离心管中。 4. 在室温条件下将新离心管以 10,000×g 离心 20 分钟以去除杂质。 5. 将含有澄清血浆的上清液转移到新管中，不要干扰沉淀，并将其置于冰上，直到准备好进行分离 6. 继续步骤“外泌体分离（用蛋白酶处理）”或“外泌体分离（无蛋白酶处理）”。 IIA:外泌体分离（用蛋白酶处理）： 建议使用蛋白酶 K处理以去除大部分血浆中蛋白质，但它可能导致部分暴露在外泌体表面的蛋白质降解（可能蛋白浓度会降低），若这与您的研究内容有冲突，可选择“分离外泌体（未经蛋白酶处理）操作步骤。 1. 从上一步分离的不含细胞的上清液中取所需体积至新管中，并加入0.5倍体积1×PBS。 2. 将混合溶液彻底涡旋混匀。 3. 向样品中加入 0.05 倍体积的蛋白酶 K。例如：对于100µl起始体积的血浆，加入5µl蛋白酶 K 溶液。 4. 涡旋样品，将溶液试管置于37℃下孵育10分钟。 5. 加入 0.2 倍体积（即总体积=血浆+PBS）的血浆外泌体提取试剂至上述溶液中。 总体积=血浆+PBS 血浆外泌体提取试剂 100µl+50µl 30µl 1ml+0.5ml 300µl 6. 充分混合经蛋白酶 K处理的血浆/血浆外泌体提取试剂混合物通过涡旋或倒置直到溶液均匀。（注意：此时溶液应该会轻微混浊。） 7. 将样品在 2-8°C下孵育30分钟。 8. 孵育后，将样品在室温下以10,000×g离心5分钟。（注意：对于小鼠血浆，在4°C下离心30分钟。） 9. 通过移液器吸出上清液并丢弃，此时外泌体包含在试管底部的颗粒中。 10. （可选步骤）再次以10,000×g转速离心试管30秒收集任何可能残留试剂，小心吸弃任何残留的上清液。 11. 继续“外泌体重悬”步骤 IIB: 外泌体分离（无蛋白酶处理）： 1. 从上一步分离的不含细胞的上清液中取所需体积至新管中，并加入 0.5 倍体积1×PBS。 2. 将混合溶液彻底涡旋混匀。 3. 加入0.2倍体积（即总体积=血浆+PBS）的血浆外泌体提取试剂至上述溶液中。 总体积=血浆+PBS 血浆外泌体提取试剂 100µl+50µl 30µl 1ml+0.5ml 300µl 4. 充分混合血浆/血浆外泌体提取试剂混合物通过涡旋或吹打直到溶液彻底均匀。（注意：此时溶液应该会轻微混浊。） 5. 将样品在室温下孵育10分钟。 6. 孵育后，将样品在室温下以10,000 × g离心5分钟 7. 通过移液器吸出上清液并丢弃，外泌体包含在试管底部的颗粒中。 8. （可选步骤）再次以 10,000×g 离心管 30 秒收集任何残留试剂，小心吸弃任何残留的上清液 9. 继续“外泌体重悬”步骤 III: 外泌体重悬 1. 将 1×PBS 或类似缓冲液添加到颗粒中并上下涡旋或吸管以重悬外泌体。 起始血浆体积 重悬体积 100µl 25-50µl 1ml 100-500µl 2. 当沉淀重新悬浮之后，所得的外泌体即可进行下游分析或通过亲和层析进一步纯化 3. 提纯后的外泌体可在 2-8℃中保存1周或在小于-20℃中长期保存 【注意事项】 1. 血浆分离后尽快进行外泌体分离，保存在 4℃和-80℃都会对产量有一定的影响。 2. 本品仅限用于科研实验

【保存条件】 4ºC保存，有效期1年 【概述】 外泌体是含有复杂RNA和蛋白质的小囊泡（30-120 nm），所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体被认为是细胞间的信使，在特定细胞之间传递其效应物或向大分子发出信号，然而它们的形成、组成以及涉及它们的生物学途径仍未完全了解。 【操作方法】 I: 样品准备： 1. 取出血浆样品并置于冰上。如果样品是冷冻的，将样品在25-37°C的温度下水浴解冻直到完全变成液体，然后放在冰上直到下面操作开始。 2. 室温下以2000×g离心血浆样品20分钟以去除细胞和碎片。 3. 在不干扰沉淀的情况下将部分澄清的上清液血浆转移到新离心管中。 4. 在室温条件下将新离心管以 10,000×g 离心 20 分钟以去除杂质。 5. 将含有澄清血浆的上清液转移到新管中，不要干扰沉淀，并将其置于冰上，直到准备好进行分离 6. 继续步骤“外泌体分离（用蛋白酶处理）”或“外泌体分离（无蛋白酶处理）”。 IIA:外泌体分离（用蛋白酶处理）： 建议使用蛋白酶 K处理以去除大部分血浆中蛋白质，但它可能导致部分暴露在外泌体表面的蛋白质降解（可能蛋白浓度会降低），若这与您的研究内容有冲突，可选择“分离外泌体（未经蛋白酶处理）操作步骤。 1. 从上一步分离的不含细胞的上清液中取所需体积至新管中，并加入0.5倍体积1×PBS。 2. 将混合溶液彻底涡旋混匀。 3. 向样品中加入 0.05 倍体积的蛋白酶 K。例如：对于100µl起始体积的血浆，加入5µl蛋白酶 K 溶液。 4. 涡旋样品，将溶液试管置于37℃下孵育10分钟。 5. 加入 0.2 倍体积（即总体积=血浆+PBS）的血浆外泌体提取试剂至上述溶液中。 总体积=血浆+PBS 血浆外泌体提取试剂 100µl+50µl 30µl 1ml+0.5ml 300µl 6. 充分混合经蛋白酶 K处理的血浆/血浆外泌体提取试剂混合物通过涡旋或倒置直到溶液均匀。（注意：此时溶液应该会轻微混浊。） 7. 将样品在 2-8°C下孵育30分钟。 8. 孵育后，将样品在室温下以10,000×g离心5分钟。（注意：对于小鼠血浆，在4°C下离心30分钟。） 9. 通过移液器吸出上清液并丢弃，此时外泌体包含在试管底部的颗粒中。 10. （可选步骤）再次以10,000×g转速离心试管30秒收集任何可能残留试剂，小心吸弃任何残留的上清液。 11. 继续“外泌体重悬”步骤 IIB: 外泌体分离（无蛋白酶处理）： 1. 从上一步分离的不含细胞的上清液中取所需体积至新管中，并加入 0.5 倍体积1×PBS。 2. 将混合溶液彻底涡旋混匀。 3. 加入0.2倍体积（即总体积=血浆+PBS）的血浆外泌体提取试剂至上述溶液中。 总体积=血浆+PBS 血浆外泌体提取试剂 100µl+50µl 30µl 1ml+0.5ml 300µl 4. 充分混合血浆/血浆外泌体提取试剂混合物通过涡旋或吹打直到溶液彻底均匀。（注意：此时溶液应该会轻微混浊。） 5. 将样品在室温下孵育10分钟。 6. 孵育后，将样品在室温下以10,000 × g离心5分钟 7. 通过移液器吸出上清液并丢弃，外泌体包含在试管底部的颗粒中。 8. （可选步骤）再次以 10,000×g 离心管 30 秒收集任何残留试剂，小心吸弃任何残留的上清液 9. 继续“外泌体重悬”步骤 III: 外泌体重悬 1. 将 1×PBS 或类似缓冲液添加到颗粒中并上下涡旋或吸管以重悬外泌体。 起始血浆体积 重悬体积 100µl 25-50µl 1ml 100-500µl 2. 当沉淀重新悬浮之后，所得的外泌体即可进行下游分析或通过亲和层析进一步纯化 3. 提纯后的外泌体可在 2-8℃中保存1周或在小于-20℃中长期保存 【注意事项】 1. 血浆分离后尽快进行外泌体分离，保存在 4℃和-80℃都会对产量有一定的影响。 2. 本品仅限用于科研实验

【保存条件】 4ºC保存，有效期一年 【概述】 外泌体是含有复杂RNA和蛋白质的小囊泡（30-120 nm），所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体被认为是细胞间的信使，在特定细胞之间传递其效应物或向大分子发出信号，然而它们的形成、组成以及涉及它们的生物学途径仍未完全了解。 外泌体功能和运输的生物学研究要求完整的外泌体的分离，但是目前使用的方法繁琐，非特异性且困难。ECOTOP细胞培养基上清外泌体提取试剂为从细胞培养基样品中浓缩完整外泌体提供了一种简单而可靠的方法。通过束缚水分子，从细胞培养基中分离总外泌体试剂可将溶解度较低的组分（即外泌体）从溶液中挤出，从而允许它们在短暂，低速离心后收集。 ECOTOP细胞培养基上清外泌体提取试剂可以从细胞培养基样品中快速高效地富集完整的外泌体。•为任何类型的下游应用最大限度地大大提高完整外泌体的回收率• 使用简单可靠的实验方案轻松分离外泌体• 避免耗时的超速离心• 灵活性极佳—可以根据样品量按比例增加或减少 【操作方法】 样品处理： 1. 收集细胞培养基。 2. 以2000×g离心细胞培养基30分钟使细胞和碎屑沉淀。 3. 将不含细胞的上清液转移至新管中，注意不要吸到管底的细胞及碎屑。 外泌体分离： 1. 从上一步分离的不含细胞的上清液中取所需体积至新管中，并加入0.5倍体积的ECOTOP细胞培养基上清外泌体提取试剂。如1ml上清液加入0.5ml提取试剂，或10ml上清液加入5ml提取试剂。 2. 将上清液与提取试剂吹打混匀或涡旋混匀。 3. 将混匀好的样品2-8℃过夜孵育。 4. 孵育完成后，在2-8℃条件下10000×g离心1小时。 5. 完成离心后，吸走并丢弃上清液，外泌体即包含在试管底部的沉淀中（大多数情况下是不可见的）。 6. 加入合适体积的1×PBS或其他类似缓冲液重悬沉淀。具体见下表： 开始实验时所使用的上清液体积 重悬所需缓冲液体积 1ml 25-100μl 10ml 100μl-1ml 7. 当沉淀重新悬浮之后，所得的外泌体即可进行下游分析或通过亲和层析进一步纯化。提纯后的外泌体可在2-8℃中保存1周或在小于-20℃中长期保存。 【注意事项】 1. 本试剂可室温保存，4℃保存也可。 2. 取上清注意避免吸入细胞或细胞碎片（重要！），合并相同的细胞培养液上清样品，装入无菌的玻璃瓶，可在4℃短期保存（1-2天），长期保存可冻存于-80℃。 3. 细胞上清分离后尽快进行外泌体分离，保存在 4℃和-80℃，都会对产量有一定的影响。 4. 做少量WB实验一般 1ml 细胞培养上清液或尿液样本基本足够，但为了足量分离 外泌体做RNA或蛋白质分析，我们推荐使用大于 10ml 样本量来分离 外泌体。 5. 分离外泌体可用于细胞功能研究或根据后续研究加入相应 Trizol或蛋白裂解液抽提 RNA或蛋白质或 1:100 PBS稀释行粒径检测； 6. 本品仅限用于科研实验。