【保存条件】-20℃保存一年【操作方法】A: 对于贴壁细胞：用 PBS 洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用 EDTA 溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 对于悬浮细胞：用预冷的 PBS 清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。C: 对于组织：建议先用将组织剪成小块，然后使用匀浆器加入预冷缓冲液 C 匀浆（冰上处理）。注意：手动方法可能适用于某些软组织，例如大脑。1. 从组织/细胞中提取各组分蛋白①使用前在 Buffer C、N、M 中加入蛋白酶抑制剂(磷酸化研究则需同时添加磷酸酶抑制剂，现配现用)。②收集细胞，建议数量量 5-10×10 6个细胞，加入 240μl 移液预冷缓冲液 C（含抑制剂）。如有必要，可以增加使用更多缓冲液 C。不建议降低使用量，因为如果溶液变得太稠，这将影响细胞成分的分离。组织量最小不小于 40mg（每 g组织加入约 2ml 预冷缓冲液 C），太小的组织蛋白提取出来后浓度过低。③通过涡旋使细胞充分分散，持续 20 秒或至细胞完全分散。若细胞贴壁过紧无法涡旋分散则用移液器吹打至均匀，组织则加入缓冲液 C 后低温匀浆至完全均质化。④在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。⑤将混合物在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。吸出上清液并将其保存到另一个干净离心管中，上清液即为细胞质蛋白。沉淀包含膜、细胞核部分，放在冰上继续后续操作。离心转速越高越利于分离，离心时间亦可延长至 20 分钟。⑥加入 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。每克组织加入 1.5ml 预冷缓冲液 C 清洗。⑦在 4°C 下孵育混合物 5 分钟（震荡孵育有助于更好清洗）。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。⑧在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞质蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。⑨向沉淀中加入 100μl 预冷缓冲液 N，并从上一步骤中重悬沉淀。⑩在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。11.在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，核蛋白位于该上清液中。剩余含膜蛋白沉淀离心管放在冰上，继续下游操作。12. 用每克组织 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。13. 在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞核蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。14. 向沉淀中加入每克组织 100μl 预冷缓冲液 M 并重悬。15. 在 4°C 下摇床震荡轻轻混合混合物 20 分钟（可增加超声 10 秒促溶解）。建议增加超声过程有助于膜蛋白的溶解，10 秒每次，可多次超声。16. 在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，膜蛋白位于该上清液中。【注意事项】1. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】-20℃保存一年【操作方法】A: 对于贴壁细胞：用 PBS 洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用 EDTA 溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。（注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 对于悬浮细胞：用预冷的 PBS 清洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。C: 对于组织：建议先用将组织剪成小块，然后使用匀浆器加入预冷缓冲液 C 匀浆（冰上处理）。注意：手动方法可能适用于某些软组织，例如大脑。1. 从组织/细胞中提取各组分蛋白①使用前在 Buffer C、N、M 中加入蛋白酶抑制剂(磷酸化研究则需同时添加磷酸酶抑制剂，现配现用)。②收集细胞，建议数量量 5-10×106个细胞，加入 240μl 移液预冷缓冲液 C（含抑制剂）。如有必要，可以增加使用更多缓冲液 C。不建议降低使用量，因为如果溶液变得太稠，这将影响细胞成分的分离。组织量最小不小于 40mg（每 g组织加入约 2ml 预冷缓冲液 C），太小的组织蛋白提取出来后浓度过低。③通过涡旋使细胞充分分散，持续 20 秒或至细胞完全分散。若细胞贴壁过紧无法涡旋分散则用移液器吹打至均匀，组织则加入缓冲液 C 后低温匀浆至完全均质化。④在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。⑤将混合物在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。吸出上清液并将其保存到另一个干净离心管中，上清液即为细胞质蛋白。沉淀包含膜、细胞核部分，放在冰上继续后续操作。离心转速越高越利于分离，离心时间亦可延长至 20 分钟。⑥加入 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。每克组织加入 1.5ml 预冷缓冲液 C 清洗。⑦在 4°C 下孵育混合物 5 分钟（震荡孵育有助于更好清洗）。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。⑧在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞质蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。⑨向沉淀中加入 100μl 预冷缓冲液 N，并从上一步骤中重悬沉淀。⑩在 4°C 下孵育混合物 10 分钟（震荡孵育有助于更好裂解）。11.在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，核蛋白位于该上清液中。剩余含膜蛋白沉淀离心管放在冰上，继续下游操作。12. 用每克组织 300μl 预冷缓冲液 C（无需蛋白酶抑制剂等）洗涤并重悬沉淀。本步骤主要目的是清洗，低温下有利于蛋白稳定。13. 在 4°C 下再次以最高转速或 13,000 g 转速下离心 10 分钟。小心地倒掉上清液并丢弃，必要时用纸巾擦拭管子的边缘。该洗涤步骤仅有助于减少与细胞核蛋白的交叉污染，如果需要，可以重复多一次该步骤以减少交叉污染。14. 向沉淀中加入每克组织 100μl 预冷缓冲液 M 并重悬。15. 在 4°C 下摇床震荡轻轻混合混合物 20 分钟（可增加超声 10 秒促溶解）。建议增加超声过程有助于膜蛋白的溶解，10 秒每次，可多次超声。16. 在 4°C 下以最高转速或 13,000 g 离心 10 分钟。取出上清液并将其保存到另一个离心管中，膜蛋白位于该上清液中。【注意事项】1. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】4℃保存，有效期 1 年【概述】考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由 465nm 变为 595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值 A595 与蛋白质浓度成正比。本试剂盒和常规的 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒相比可以兼容一系列常见的去垢剂，和 BCA 法相比，能兼容高浓度的还原剂，并且检测速度极快，在检测含去垢剂样品蛋白浓度时，比 BCA 法更加便捷。生命科学研究中的很多蛋白样品都是含有去垢剂的，因此常规Bradford 法的使用受到了很大的限制，通常只能使用可以兼容去垢剂但检测比较耗时的 BCA法。如果使用本试剂盒，不仅 能兼容去垢剂，而且由于能立即显色，检测速度会比 BCA 法快很多。当蛋白样品中同时含有一定浓度的去垢剂和还原剂时，常规的 Bradford 法和 BCA法就都不能使用了，而本试剂盒仍然是可以检测的。本试剂盒测定蛋白浓度时不受较高浓度去垢剂的影响，可以很好地兼容 1% Triton X-100、1% Tween 20、1% SDS、1% NP-40 和 1% Brij35 等去垢剂。本试剂盒检测灵敏度高，最小蛋白检测量达到 0.5μg。【使用方法】1. 蛋白标准液的准备a. 蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，如果蛋白样品所在溶液不含有干扰本试剂盒检测的物质，也可以用 0.9%NaCl、PBS 或水稀释标准品。蛋白标准液(20mg/ml BSA)如果冻存，请完全融化并混匀后使用。b. 按照下表配制 0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5mg/ml 蛋白标准。每次稀释时注意充分混匀。如果有必要可以增加设置 0.0625mg/ml 的蛋白标准。2. 蛋白浓度测定a. 取 10µl 不同浓度蛋白标准加到 96 孔板的蛋白标准孔中。b. 取 10µl 样品到 96 孔板的样品孔中。如果样品不足 10µl，需加标准品稀释液补足到 10µl。请注意记录样品体积。c. 各孔加入 250µl G250 染色液。d. 用酶标仪测定 A595，或 560-610nm 之间的其它波长的吸光度。可以立即测定吸光度，也可以在最长 2 小时内测定，一般来说 2 小时内检测数据无显著变化。e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。【注意事项】1. 本品 BSA 因每次使用量较小，推荐分装使用。2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

AO/PI双染色试剂盒使用说明书 【包装规格】 产品编号 产品名称 包装 EK-5807 AO/PI Staining Kit 100T/500T 使用说明书 1份 【试剂盒组成】 产品编号 产品名称 100T 500T EK-5807A AO染色液 0.5ml 2.5ml EK-5807B PI 染色液 1ml 5ml EK-5801C 10×染色缓冲液 10ml 50ml 【保存条件】 4℃避光保存有效期6个月，-20℃避光保存有效期12个月 【概述】 吖啶橙（Acridine Orange，AO）为一种荧光染料，该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。其激发波长为488nm，吸收波长为515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，复合物可发出不同颜色的荧光，红色荧光为AO-DNA(F>600nm)，绿色荧光为AO-RNA或单链DNA(F>530nm)。在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。 Propidium Iodide是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。因此，在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，早期凋亡细胞呈微弱红光，晚期凋亡细胞红光加强，坏死细胞呈强红色荧光。 【使用方法（仅供参考）】 1. 染色缓冲液及工作液的配制： ①　根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。取100μL10×染色缓冲液加900μL无菌去离子水稀释，混匀即成1×染色缓冲液。 ①　每500μL1×染色缓冲液加入5μL AO染色液和10μL PI染色液，充分混匀，即成染色工作液。 注：不同细胞样本的染色浓度和时间有差异，可以根据预实验结果调整染色液浓度。以上条件适合大多数细胞样本。 2. 悬浮细胞染色 ①　收集样本细胞，细胞数量在10×105个以内。 ②　用PBS洗涤细胞两次。 ③　用500μL染色工作液将细胞重悬。 ④　轻轻混匀后4℃避光孵育10～20分钟。 ⑤　用PBS洗涤细胞。 ⑥　用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。 3. 贴壁细胞原位染色 ①　用PBS洗涤细胞两次。 ②　注意洗细胞过程不要丢失细胞，需要离心收集漂浮细胞。 ③　细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。 ④　37℃孵育细胞10～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。（若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。）⑤　吸干染色工作液，用培养基洗培养板或盖玻片2～3次，每次用预热的培养基覆盖所有细胞，然后吸干培养基。 4. 结果分析： ①　在荧光显微镜下，选用488nm激发光镜检： ②　AO染色正常细胞DNA呈均匀黄色或黄绿色，形态结构正常。 ③　当细胞凋亡时，染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染。坏死细胞呈强红色荧光。 【注意事项】 1. 仅用于实验室，不适合农业/家庭/临床用途使用。 2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

AO/PI双染色试剂盒使用说明书 【包装规格】 产品编号 产品名称 包装 EK-5807 AO/PI Staining Kit 100T/500T 使用说明书 1份 【试剂盒组成】 产品编号 产品名称 100T 500T EK-5807A AO染色液 0.5ml 2.5ml EK-5807B PI 染色液 1ml 5ml EK-5801C 10×染色缓冲液 10ml 50ml 【保存条件】 4℃避光保存有效期6个月，-20℃避光保存有效期12个月 【概述】 吖啶橙（Acridine Orange，AO）为一种荧光染料，该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。其激发波长为488nm，吸收波长为515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，复合物可发出不同颜色的荧光，红色荧光为AO-DNA(F>600nm)，绿色荧光为AO-RNA或单链DNA(F>530nm)。在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。 Propidium Iodide是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。因此，在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，早期凋亡细胞呈微弱红光，晚期凋亡细胞红光加强，坏死细胞呈强红色荧光。 【使用方法（仅供参考）】 1. 染色缓冲液及工作液的配制： ①　根据样品数按下列比例配制染色缓冲液。取100μL10×染色缓冲液加900μL无菌去离子水稀释，混匀即成1×染色缓冲液。 ①　每500μL1×染色缓冲液加入5μL AO染色液和10μL PI染色液，充分混匀，即成染色工作液。 注：不同细胞样本的染色浓度和时间有差异，可以根据预实验结果调整染色液浓度。以上条件适合大多数细胞样本。 2. 悬浮细胞染色 ①　收集样本细胞，细胞数量在10×105个以内。 ②　用PBS洗涤细胞两次。 ③　用500μL染色工作液将细胞重悬。 ④　轻轻混匀后4℃避光孵育10～20分钟。 ⑤　用PBS洗涤细胞。 ⑥　用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。 3. 贴壁细胞原位染色 ①　用PBS洗涤细胞两次。 ②　注意洗细胞过程不要丢失细胞，需要离心收集漂浮细胞。 ③　细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。 ④　37℃孵育细胞10～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。（若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。）⑤　吸干染色工作液，用培养基洗培养板或盖玻片2～3次，每次用预热的培养基覆盖所有细胞，然后吸干培养基。 4. 结果分析： ①　在荧光显微镜下，选用488nm激发光镜检： ②　AO染色正常细胞DNA呈均匀黄色或黄绿色，形态结构正常。 ③　当细胞凋亡时，染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染。坏死细胞呈强红色荧光。 【注意事项】 1. 仅用于实验室，不适合农业/家庭/临床用途使用。 2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】建议分装冻存，避免反复冻融，-20℃避光保存，有效期1年【概述】5×SDS-PAGE单色蛋白上样缓冲液可保护蛋白质在样品制备步骤中免受热降解，并在SDS-PAGE运行期间防止pH值变化。一些蛋白质对在Tris缓冲液中电泳期间温度波动引起的pH变化敏感，优化后的上样缓冲液组分可防止在SDS-PAGE电泳之前的样品加热过程中以及电泳过程中蛋白质降解。SDS可与蛋白质结合使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，这时蛋白质本身的电荷完全被SDS掩盖，消除了各种蛋白质本身电荷的差异；SDS还可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。溴酚蓝作为指示剂，用于追踪电泳进度。【使用建议】1. 室温或37℃水浴解冻5×SDS-PAGE单色蛋白上样缓冲液，并摇晃混匀。2. 请按每40μl蛋白样品加入10μl上样缓冲液的比例(五倍稀释)来使用。如果蛋白样品浓度过高，可用双蒸水稀释。3. 混匀后，100℃水浴加热5-10分钟，使蛋白变性。4. 冷却至室温后，10000-14000rpm离心2-5分钟，取上清直接上样电泳即可。【注意事项】1. 该产品于-20℃保存时会出现SDS沉淀，使用前请确保溶液完全复溶混匀，有必要时可置于37℃水浴促溶。2. 蛋白上样缓冲液含有溴酚蓝指示剂，PH值受保存温度影响，在低温冻存状态下，溶液可能会呈现深棕色，不影响产品使用。3. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】 4℃保存，一年有效。室温保存，至少2周内有效。-20℃可以保存更长时间。 【概述】 本产品能够快速、温和、有效地抽提昆虫细胞或组织的总蛋白，抽提的蛋白能较好地保持其原有的空间结构和生物学活性，可用于多种生物化学和细胞生物学用途。例如，带有His、GST、HA、Flag、Myc、V5等标签蛋白的分离纯化，免疫印迹(Western blot)、免疫沉淀(Immunoprecipitation)、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)和ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)等常规生化分析，luciferase、β-gal、alkaline phosphatase、chloramphenicol acetyltransferase (CAT)等报告基因(Report gene)酶活性检测，PKA、PKC和酪氨酸激酶(tyrosine kinase)等蛋白激酶活力的检测等方面的用途。 【操作方法】 1. 溶液的准备 取适量的昆虫活性蛋白抽提试剂，根据具体实验目的加入适量的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，也可以根据实验目的选不含磷酸酶抑制剂的蛋白酶抑制剂混合物。放置于冰浴备用。 2. 悬浮培养昆虫细胞的蛋白抽提 a. 收集细胞：对细胞进行计数，并确定总的细胞数。800g室温离心5min，弃上清。 b. 洗涤细胞(可选做)：用PBS洗涤细胞，800g室温离心5min，弃上清。如有必要，可以再重复洗涤一次。 c. 裂解细胞：弹击离心管底，使细胞沉淀适当分散开。每0.5-2×107个细胞加入冰浴预冷的1ml 昆虫活性蛋白抽提试剂，用移液器吹打混匀，再以中速涡悬震荡约5秒后置于冰上孵育10min。如果希望获得更多的蛋白，或者对于一些较难裂解提取的蛋白，则需要额外的孵育时间以提高得率。额外的孵育时间，可能会增加蛋白得率。 d. 12,000-16,000g (16,000g更佳) 4℃离心15min。 e. 将含有可溶性蛋白的上清转移到新的离心管中，立即用于后续分析检测，或者-20℃或-80℃保存备用。如有必要，可以考虑保留沉淀物用于后续分析。 3. 贴壁培养昆虫细胞的蛋白抽提 a. 洗涤细胞(可选做)：吸除培养液，加入适量PBS，轻轻摇动，吸除PBS重复洗涤一次。如有必要，可以再重复洗涤一次。 洗涤过程中应尽量避免贴壁细胞的脱落，如果发生细胞脱落，可以收集相应的培养液或PBS溶液，800g离心5min，以沉淀并收集脱落的细胞。 b. 裂解细胞:吸净细胞培养液或洗涤液，参考下表，加入适量的昆虫活性蛋白抽提试剂，冰上孵育10min。冰上孵育期间，可以将培养器皿放置在水平或侧摆摇床上剧烈摇动、敲击细胞培养瓶细胞培养侧的外壁或用细胞刮刮下贴壁细胞。通常直接孵育5-6min后，昆虫细胞会逐渐出现从培养器皿表面脱落的现象。 培养板/皿 表面积（cm2） 裂解液用量(μl) 10-cm dish 55 500-1000 6-cm dish 21 200-400 6孔板 9.5 100-200 12孔板 3.8 50-100 24孔板 1.9 25-50 48孔板 0.95 12.5-25 96孔板 0.32 5-10 c. 用移液器将细胞抽提产物吹打悬起并转移到离心管中，12,000-16,000g (16,000g更佳) 4℃离心15min。 d. 将含有可溶性蛋白的上清转移到新的离心管中，立即用于后续分析检测，或者-20℃或-80℃保存备用。如有必要，可以考虑保留沉淀物用于后续分析。吸取上清时触及沉淀会导致抽提产物中含有更多的杂蛋白等 【注意事项】 1. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。 2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】 4℃保存，一年有效。室温保存，至少2周内有效。 【概述】 本产品能够快速、温和、有效地在不需要机械破碎的情况下温和地从革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中提取蛋白质，抽提的蛋白能较好地保持其原有的空间结构和生物学活性，可用于多种生物化学和细胞生物学用途如亲和纯化等。 【产品特点】 即用型—在 Tris 或磷酸盐缓冲液配方中使用温和的非离子去污剂（专有）对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的一步法细胞裂解 快速且简便—只需将 EasyLys-B试剂加入细菌沉淀中，通过混合10-15分钟进行孵育并在粒化细胞碎片后回收各种可溶蛋白 可兼容—完全可与添加蛋白酶抑制剂兼容，所获得的蛋白提取物可被用于蛋白测定、各种常见的亲和纯化方法（如 GST、6xHis）和其他应用 【操作方法】 1. 离心收集细菌细胞：以5000×g的速度离心10分钟，收集细菌细胞沉淀。称量菌体重量，并继续进行下一步，或将菌体冻存在-20°C到-80°C之间。 2. 准备裂解液：将所需量的EasyLys-B试剂（每克菌体沉淀加入5 mL试剂）恢复至室温。添加相应蛋白酶抑制剂，现配现用。 注意：对新鲜制备的革兰氏阴性细胞（如E. coli BL21菌株）裂解时，向试剂中加入最终浓度为1 mM的EDTA（即每毫升EasyLys-B试剂加入2µL的0.5M EDTA）。可选择添加溶菌酶至终浓度0.2mg/ml，可增强裂解。选择添加Benzonase全能核酸核至终浓度50U/ml，可降解裂解后液体粘秱度。 3. 加入裂解液：按每克细胞沉淀加入5 mL裂解液（含蛋白酶抑制剂/EDTA等）。用移液器上下吸打悬液(或涡旋)，直至完全均匀。 4. 室温孵育：在室温下轻轻摇动孵育15分钟。 5. 离心分离：以16,000×g的速度离心20分钟，以分离可溶性蛋白和不溶性蛋白。 6. 小心地从细胞碎片中吸取上清可溶性蛋白部分至另一新管中。使用SDS-PAGE和/或Western blot分析上清液和不溶性部分，以确定哪一部分含有目标蛋白。 【故障排除】 问题 可能原因 解决方法 蛋白质产量低 细菌裂解不充分 将裂解孵育时间延长至1小时 将裂解缓冲液与细胞沉淀物的比例提高至每克菌体沉淀加10mL裂解液 为了提高裂解率，请将细菌沉淀进行至少经过一次冻融循环 【注意事项】 1. 该产品仅实验室使用，不适合农业/家庭/临床用途使用。 2. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】4℃保存，有效期1年。【概述】哺乳动物活性蛋白抽提试剂(EasyLys-M Mammalian Native Protein Extraction Reagent)，是一种用于快速、高质量、高产量、高活性提取哺乳动物细胞或组织的细胞浆蛋白、细胞核蛋白以及膜蛋白的活性蛋白提取试剂。本品与Thermo的M-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent以及Sigma的CelLytic™ M mammalian cell lysis/extraction reagent非常相近，使用效果和用途也非常相近，很多时候可以考虑相互替代。 本试剂制备的细胞裂解物可直接与各种报告基因检测（例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶）、蛋白激酶检测（例如 PKA、PKC、酪氨酸激酶）、免疫检测（例如 Western 免疫印迹、ELISA、RIA）和/或蛋白纯化程序兼容。【产品特点】l 兼容性强：抽提的可溶性蛋白处于非变性状态，可直接用于免疫沉淀反应和其他亲和纯化过程l 作用温和：温和的除垢剂裂解，产生的抽提物直接与考马斯(Bradford)和BCA蛋白定量分析试剂或SDS-PAGE兼容l 非变性：维持荧光素酶、β-半乳糖苷酶、CAT和其他报告基因的活性，与其他供应商的产品和冷冻/解冻方法一样好或更出色l 操作简单：贴壁细胞直接在板上裂解或者在剥离和洗涤后悬浮于溶液中【使用建议】取1ml的预冷裂解液中加入相应体积蛋白酶抑制剂混合物（如需磷酸化研究则需添加磷酸酶抑制剂）；混匀，放置在冰上备用；1. 样品前处理（具体用量参考表1）：a) 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔细胞量加入100-200μl裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。b) 对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞量加入100-200μl裂解液的比例加入裂解液，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。c) 对于组织样品：把组织剪切成细小的碎片。按照每20mg组织加入200-400μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量)。用玻璃匀浆器或其它设备匀浆，直至充分裂解。2. 后处理：冰上或4℃振荡孵育裂解5-10分钟（振荡孵育有助于提升裂解效率，组织可延长裂解时间至20分钟）。将裂解后的样品最大转速或14000g于4℃下离心5-10分钟，取上清蛋白质转移到新的离心管中，即可进行后续的蛋白浓度测定、SDS-PAGE、Western blotting和免疫沉淀等操作。（暂时不使用蛋白尽快保存于-80℃中，即用即取，避免反复冻融，避免长时间冻存）。表1. 不同规格的细胞培养器皿中EasyLys-M 哺乳动物活性蛋白抽提试剂的用量表。细胞孔板或培养皿面积（cm2）提取试剂用量100mm55500-1000μl60mm21200-400μl6-well plate9.5100-200μl24-well plate1.925-50μl96-well plate0.325-10μl【注意事项】1. 抽提蛋白产量低可能性：a. 细胞或组织裂解不充分。延长冰上孵育时间或在孵育期间适当摇动，或适当增加蛋白抽提试剂的使用量。b. 蛋白发生降解。加入蛋白酶抑制剂可抑制蛋白降解。c. 组织匀浆不太充分。适当延长匀浆或研磨时间。d. 蛋白溶液的粘稠度太高。一方面可以考虑加大抽提试剂的用量，另一方面可以考虑添加全能核酸酶等以降低粘稠度2. 该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

【保存条件】室温保存,有效期一年【概述】细胞或组织用多聚甲醛、甲醛或其它醛类试剂固定后，会导致蛋白之间的交联(cross-link)，从而遮蔽样品的抗原位点，导致免疫染色时染色信号减弱，甚至出现一些假阳性染色结果。本抗原修复液含有了广泛使用的SDS等抗原修复试剂等，pH值约为7.4，可以快速有效地去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。【操作方法】1. 对于石蜡切片: a. 脱蜡:切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90%乙醇5 分钟，两次，70%乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。 b. 抗原修复:用重蒸水或Milli-Q水将本抗原修复液(5×)稀释5倍，配制成抗原修复液(1×)，例如1ml本抗原修复液(5×)加入 4ml去离子水混合均匀，即得5ml抗原修复液(1×)。将切片浸泡在抗原修复液(1×)中，室温孵育5分钟。用免疫染色洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟，以充分去除残留的SDS等试剂。随后即可进行封闭等后续的免疫染色步骤。 2. 对于冰冻切片: 用免疫染色洗涤液洗涤切片5分钟。将切片浸泡在抗原修复液(1×)中，室温孵育约5分钟。用免疫染色洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟，以充分去除残留的SDS等试剂。随后即可进行封闭等后续的免疫染色步骤。 3. 对于其它样品的抗原修复，可以参考石蜡切片或冰冻切片的步骤进行。【注意事项】1. 为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。2. 低温储存后可能会有析出，若出现析出或沉淀，可适当加热即溶解，不影响使用效果。